- Nhiệt độ thích hợp:
+ Giai đoạn nuôi sợi: 200C - 300C + Giai đoạn quả thể: 220C - 280C
- Độ ẩm:
+ Độ ẩm cơ chất: 60% - 62% + Độ ẩm không khí: 80 - 95%
- Độ thông thoáng: Trong suốt quá trình nuôi sợi và phát triển quả thể, nấm Linh Chi đều cần có độ thông thoáng tốt.
- Ánh sáng:
+ Giai đoạn nuôi sợi: không cần ánh sáng.
+ Giai đoạn phát triển quả thể: cần ánh sáng tán xạ (ánh sáng đọc được). Cường độ ánh sáng cân đối từ mọi phía.
- Độ pH: Linh Chi thích nghi trong môi trường trung tính đến axit yếu (pH=5.5 – 7).
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là:
- Giống nấm Linh Chi: Ganodema neo-japonicum và Ganoderma sp được lấy từ phòng thí nghiệm nấm Vườn quốc gia Cát Tiên.
- Mẫu nấm G.neo-japonicum và G.sp được lấy từ bộ sưu tập tại Vườn quốc gia Cát Tiên sử dụng cho các nghiên cứu về hình thái, hiển vi của 2 loài nấm này.
2.1.2.Dụng cụ và trang thiết bị
- Bếp gas - Bình tam giác
- Bông gòn không thấm nước - Cân phân tích
- Cốc thủy tinh - Dao cắt mô - Đèn cồn - Đĩa petri
- Găng tay cao su - Nồi hấp Autoclave - Ống nghiệm
- Pank cấy - Tủ cấy - Tủ sấy
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát tốc độ tăng trưởng và đặc điểm của tơ nấm trên môi trường thạch – môi trường nhân giống cấp 1 thạch – môi trường nhân giống cấp 1
Để xác định môi trường thích hợp nhất cho việc bảo quản và nhân giống cấp 1, chúng tôi tiến hành khảo sát tốc độ tăng trưởng của hệ sợi nấm trên các loại môi trường có thành phần theo các công thức như sau:
Môi trường 1: Thành phần Số lượng Nước chiết *** 2 lít Glucose 40 g Agar 40 g Cao nấm men 2 g Peptone 2 g
Bảng 2.1: Công thức môi trường 1 Môi trường 2: Thành phần Số lượng Nước chiết 2 lít Glucose 40 g Agar 40 g Cao nấm men 2 g Peptone 2 g
Dung dịch dinh dưỡng 10 ml
Bảng 2.2: Công thức môi trường 2
Môi trường 3: Thành phần Số lượng Nước chiết 2 lít Glucose 40 g Agar 40 g Cao nấm men 2 g Peptone 2 g Dung dịch B1 10 ml
***: Trong đó nước chiết gồm: Khoai tây (600g), cà rốt (200g), giá đỗ (150g), nước cất, đun sôi 10 – 15 phút; lọc và bổ sung nước cất cho đủ 2 lít
Trong thí nghiệm này, môi trường được hấp khủ trùng trong nồi Autoclave ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1.4 atm trong vòng 15 – 20 phút. Sau đó cho vào bình tam giác, đĩa petri và ống thạch nghiêng.
Quá trình khảo sát tốc độ tăng trưởng của tơ được tiến hành như sau:
- Cấy các giống đã được phân lập từ các ống giống thuần chủng sang các bình tam giác, đĩa petri hoặc ống nghiệm đã chuẩn bị sẵn.
- Ủ cho tơ nấm phát triển ở nhiệt độ phòng 26-300C, quá trình ủ được tiến hành trong môi trường ánh sáng khuếch tán nhẹ 500-1000 lux
- Tiến hành quan sát và thu nhận kết quả sau mỗi ngày kể từ khi sợi nấm bắt đầu bám vào bề mặt môi trường.
- Vẽ biểu đồ và nhận xét kết quả
2.2.2. Khảo sát tốc độ tăng trưởng và đặc điểm của tơ nấm Linh chi
Ganoderma neo-japonicum và Ganoderma sp trên môi trường thóc
Môi trường hạt lúa có bổ sung cám gạo là môi trường nhân giống cấp 2 cho các giống nấm trên.
Công thức môi trường hạt thóc:
Thành phần Số lượng
Hạt thóc 89 %
Cám gạo 10 %
Vôi 1 %
Nước đủ ẩm 60 – 65 %
Bảng 2.4: Công thức môi trường hạt
Quá trình chuẩn bị môi trường thóc được tiến hành như sau: lúa ngâm trong nước lạnh khoảng 12 giờ, rửa thật sạch sau đó cho vào nồi nấu đến khi hạt thóc nở bung ra thì ngừng lại. Vớt hạt thóc ra ngoài, bổ sung thêm 10% cám gạo, 1% vôi
trộn đều. Tiến hành đổ thóc vào các bình tam giác đã chuẩn bị sẵn. Các chai thóc được hấp khử trùng ở 1210C, 1.4 atm trong nồi hấp Autoclave. Hấp xong để nguội
Để khảo sát tốc độ tăng trưởng tơ nấm ta tiến hành như sau: - Cấy giống từ môi trường thạch vào các chai thóc
- Nuôi ủ tơ ở nhiệt độ phòng
- Thu nhận kết quả từ khi tơ nấm bung ra và bám môi trường cho đến khi ăn trắng toàn bộ chai
- Nhận xét đặc điểm phát triển.
2.2.3. Dự kiến mô hình nuôi trồng thử nghiệm nấm Linh Chi Ganoderma neo-
japonicum và Ganoderma sp
2.2.3.1. Xây dựng quy trình nuôi trồng
Sau khi đã nhân giống thành công 2 đối tượng trên, chúng tôi tiến hành nuôi trồng thử nghiệm trên môi trường có các thành phần cơ chất khác nhau theo nghiệm thức (NT) sau:
Tỷ lệ thành phần cơ chất ở các nghiệm thức (%) Nghiệm
thức Mùn cưa Cám gạo Cám ngô Lá tre
Nước Sạch NT 1 85 9 6 Đủ ẩm NT 2 90 6 4 Đủ ẩm NT 3 50 50 Đủ ẩm NT 4 100 Đủ ẩm
Bảng 2.5: Tỷ lệ thành phần cơ chất có trong các nghiệm thức nuôi trồng Môi trường cơ chất có bổ sung vôi và phân DAP theo tỷ lệ: 3.5 kg phân/1000 bịch và 10kg vôi/1000 bịch.
Quá trình chuẩn bị giá thể:
- Ủ mùn cưa thành đống phủ kín bằng bạc nhựa khoảng 2-3 ngày để phân giải một phần các hợp chất khó hấp thu như cellulose, hemicelluloses, lignin… thành các hợp chất dễ hấp thụ hơn như glucose, đồng thời để cơ chất mềm ra, nấm dễ sử dụng.
- Bổ sung các phụ gia theo tỷ lệ như trên, tiến hành đảo trộn.
- Tiến hành cho cơ chất vào các bịch PP hoặc PE khoảng 1.2-1.5kg/bịch.
2.2.3.2. Hấp vô trùng tạo bịch phôi và cấy từ môi trường thóc sang môi trường mùn cưa
Nguyên liệu sau khi đã được phối trộn và tạo độ ẩm thích hợp, ta cho vào túi nilon chịu nhiệt rồi tiến hành làm cổ nút, dùi lổ và đậy nút bông không thấm nước. Bịch nguyên liệu phải được đóng căng các góc.Sau đó mang các bịch môi trường vào hấp ở nồi Autoclave trong 40 phút ở áp suất 1.4 at. Bịch hấp xong, để nơi sạch sẽ trong 12-24 giờ, chờ nguội rồi mới cấy.
Chúng tôi tiến hành cấy giống trong tủ cấy vi sinh vô trùng.
2.2.3.3. Chăm sóc và tưới đón nấm
Bịch sau khi cấy giống, được chuyển vào nhà ủ cho tơ nấm mọc, và nhà ủ cần thỏa mãn những yêu cầu sau:
- Sạch, thoáng mát và không cần ánh sáng vì trong giai đoạn này để trong bóng tối sẽ hạn chế được sự phát triển của vi sinh vật, đồng thời tơ nấm cũng sẽ phát triển nhanh hơn. Bịch đem ủ có thể xếp trên kệ và treo lên giàn, tuyệt đối không chồng chất lên nhau thành nhiều lớp, thời gian ươm kéo dài khoảng 25- 40 ngày, sợi nấm phát triển, ăn dần vào bịch nguyên liệu tạo nên màu trắng đồng nhất.
- Tưới nước: khi nấm bắt đầu nhú ra khỏi miệng cổ nút bông, tiến hành tưới nước bên ngoài bịch nấm, tưới nấm ở dạng phun sương, trung bình mỗi ngày tưới 2- 3 lần tùy theo độ ẩm môi trường.
- Thu hái nấm: nấm Linh Chi ra ở dạng 1 tai xòe ra ở đầu cổ bông, hái nấm đúng tuổi sẽ cho năng suất cao, chất lượng tốt.
2.2.3.4. Phương pháp thu nhận và xử lý kết quả
Mẫu được lấy theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên.Tất cả số liệu thực nghiệm được đo 3 lần bằng thước, đơn vị cm, lấy giá trị trung bình. Hiệu suất sinh học của 2 loài nấm Linh Chi trên giá thể là tỷ lệ giữa lượng thể quả thu hoạch/trọng lượng cơ chất. Khi nấm ra và đạt kích thước tối đa, bắt đầu có biểu hiện già ta tiến
hành thu hái. Quan sát hình thái bên ngoài, cắt ngang quả thể, đo chiều dài của tai nấm, chiều dài phi cuống nấm , mô tả và chụp hình.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm hình thái và hiển vi của Ganoderma neo-japonicum và
Gnaoderma sp
3.1.1. Ganoderma neo-japonicum
3.1.1.1. Đặc điểm hình thái
Hình 3.1: Ganoderma neo-japonicum ngoài tự nhiên
- Tán nấm thường có dạng hình thận, hình quạt hoặc bán nguyệt, thỉnh thoảng bất thường.
+ Đường kính tán nấm dao động từ 3 – 6 cm.
+ Bề mặt láng bóng, có màu nâu đỏ sậm, có mép bờ hơi nâu, trên mặt có nhiều vết nhăn xuyên tâm.
+ Mặt dưới có màu hơi nâu đến nâu.
- Cuống nấm đính bên, dài từ 6 – 13 cm, đường kính 0.3 – 0.6 cm. + Cuống nấm thường có màu sậm hơn màu tán nấm.
+ Cuống nấm thon dài.
Hình 3.2: Bào tử Ganoderma neo-japonicum
- Bào tử có dạng Ganodermoid điển hình và mang đầy đủ các đặc điểm của họ nấm Linh Chi Ganodermataceae.
- Có kích thước 10 – 12 x 7 – 8 µm, có thành dày, miệng bào tử lớn, nhiều u cục sần sùi, thuôn dài và hầu như không có sự xuất hiện của lớp chóp phủ bề mặt lổ nẩy mầm.
3.1.2. Ganoderma sp
3.1.2.1. Đặc điểm hình thái
- Tán nấm chủ yếu có dạng gần tròn, thỉnh thoảng hình bán nguyệt hay hình thận
+ Đường kính tán nấm dao động từ 5 – 8 cm
+ So với Ganoderma neo-japonicum, G.sp có bề mặt láng bóng và màu nâu đỏ nhạt hơn, phía cuối mép có màu hơi nâu, trên mặt có nhiều vết nhăn xuyên tâm riêng biệt
+ Mặt dưới có màu trắng kem dần chuyển sang màu vàng nhạt
- Có cuống gồ đính bên, dài từ 10 – 17 cm, đường kính từ 0.5 – 1 cm + Cuống nấm có màu sậm hơn so với tán nấm
+ Cuống nấm có rễ ăn sâu dài từ 5 – 8 cm
3.1.2.2. Đặc điểm vĩ mô
Hình 3.4: Bào tử của Ganoderma sp
- Bào tử có dạng Ganodermoid điển hình và mang đầy đủ các đặc điểm của họ nấm Linh Chi Ganodermataceae.
- So với Ganoderma neo-japonicum, Ganoderma sp có kích thước nhỏ 9 – 11 x 5 – 7 µm, có thành mỏng, hình dáng bằng phẳng như hình trứng cụt, có miệng bào tử nhỏ hơn và có sự xuất hiện của chóp phủ bề mặt lổ nẩy mầm.
3.2. Khảo sát sự phát triển của tơ nấm trên môi trường thạch – môi trường nhân giống cấp 1 nhân giống cấp 1
Chúng tôi tiến hành khảo sát tốc độ tăng trưởng và đặc điểm của tơ nấm bằng cách cấy chuyền các ống giống cấp 1 sang các đĩa thạch để dễ dàng quan sát.
Các đĩa thạch sau khi cấy xong vẫn được gói giấy báo vô trùng để tránh ánh sáng trực tiếp chiếu vào vì trong thời gian ủ, tơ nấm cần phát triển trong điều kiện tối. Sau 2 – 3 ngày, chúng tôi tiến hành tháo giấy báo, theo dõi và thu nhận kết quả.
Hình 3.5: Các ống giống cấp 1
3.2.1. Tốc độ tăng trưởng và đặc điểm của tơ nấm trên môi trường 1
Hình 3.6: Tốc độ tăng trưởng của tơ nấm trên môi trường 1 sau 3 ngày
G.neo-japonicum G.sp
G.lucidum
Hình 3.7: Tốc độ tăng trưởng của tơ nấm trên môi trường 1 sau 15 ngày
Bảng 3.1: Tốc độ tăng trưởng của 3 đối tượng nấm Linh Chi trên môi trường 1
Chiều dài sợi nấm (cm) Thời gian (ngày) G. lucidum (loài chuẩn) G. neo-japonicum G. sp 3 1.60 ± 0.096 2.10 ± 0.091 3.37 ± 0.140 6 3.18 ± 0.178 4.00 ± 0.060 8.81 ±0.090 9 5.49 ± 0.100 5.56 ± 0.116 12 7.79 ± 0.117 7.57 ± 0.102 15 8.80 ± 0.080 8.74 ± 0.114 G.lucidum G.sp G.neo-japonicum
Hình 3.8: Biểu đồ so sánh sự tăng trưởng của tơ nấm trên môi trường 1 ở 3 đối tượng G.lucidum, G.neo-japonicum và G.sp
Nhận xét
Sau 2 ngày đầu kể từ khi cấy giống, tơ nấm bắt đầu bung ra và phủ kín toàn bộ mô cấy tuy nhiên các sợi tơ nấm còn mảnh nên chưa bám vào bề mặt môi trường. Đến ngày thứ 3, sợi tơ nấm bắt đầu phát triển và tơ ăn lan xuống bề mặt của môi trường thạch, so với loài Linh Chi chuẩn Ganoderma lucidum bung tơ đạt 1.60 ± 0.096 cm, thì G.sp bung tơ mạnh nhất, đạt tới 3.37 ± 0.140 cm, tơ lan đều khỏe; còn
G.neo-japonicum thì chỉ đạt 2.1 ± 0.091 cm. Ngày thứ 4, thứ 5 tơ nấm của G.neo- japonicum phát triển bình thường, trong khi đó, tốc độ lan của G.sp khá nhanh. Đến ngày thứ 6 thì G.sp đã lan kín đĩa thạch, tơ nấm bện chặt và khỏe, lúc này tốc độ lan của G.neo-japonicum không hơn G.lucidum nhiều lắm, tơ nấm của G.lucidum đạt kích thước 3.18 ± 0.178 cm và tơ nấm của G.neo-japonicum đạt 4.00 ± 0.60 cm. Sau 15 ngày thì cả G.neo-japonicum và G.lucidum cùng lan kín bề mặt thạch đĩa petri.
- Tơ nấm của G.lucidum bện lại có sự phân nhánh rõ ràng, tơ nấm khỏe, lúc đầu có màu trắng bông. Sau đó, phần đầu có sự nhạt màu rồi chuyển sang hơi vàng, vàng, vàng đậm.
- Tơ nấm G.sp bện chặt và mịn có màu trắng hay trắng xỉn không thấy rõ sự phân nhánh. Đặc biệt, ở đây có sự hình thành thể quả ngay trong môi trường thạch. Đây là một hiện tượng hiếm thấy ở các loài Linh Chi.
- Tơ nấm của G.neo-japonicum mảnh hơn, sợi tơ có sự phân nhánh, đoạn cuối tơ mảnh và có hiện tượng không màu, phần đầu bắt đầu già đi và ngả màu từ trắng, trắng hơi vàng, vàng chanh, vàng, vàng đậm đến vàng hơi nâu.
Sau khi quá trình khảo sát kết thúc, ta thấy rằng sự tăng trưởng tơ nấm của G.sp
> G.lucidum > G.neo-japonicum. Qua đó, ta cũng thấy rõ sự khác biệt giữa tơ nấm của G.sp và G.neo-japonicum.
3.2.2. Tốc độ tăng trưởng và đặc điểm của tơ nấm trên môi trường 2
Hình 3.9: Tốc độ tăng trưởng của tơ nấm trên môi trường 2 sau 3 ngày
Hình 3.10: Tốc độ tăng trưởng của tơ nấm trên môi trường 2 sau 7 ngày nuôi cấy
G.neo-japonicum G.sp
G.sp G.neo-japonicum G.lucidum
Bảng 3.2: Tốc độ tăng trưởng của tơ nấm ở 3 đối tượng nấm Linh Chi trên môi trường 2
Chiều dài sợi nấm (cm) Thời gian
(ngày) G.lucidum (loài chuẩn) G.neo-japonicum G.sp 3 1.58 ± 0.006 1.78 ± 0.131 2.87 ± 0.065 6 2.60 ± 0.101 3.70 ± 0.113 8.73 ± 0.131 9 4.52 ± 0.033 5.62 ± 0.130
12 7.14 ± 0.118 7.60 ± 0.113 15 8.7 ± 0.164 8.68 ± 0.079
Hình 3.11: Biểu đồ so sánh sự tăng trưởng của tơ nấm trên môi trường 2 ở 3 đối tượng G.lucidum, G.neo-japonicum và G.sp
Nhận xét
Sau khi khảo sát sự tăng trưởng tơ nấm của 3 đối tượng trên môi trường 1, chúng tôi tiến hành khảo sát sự tăng trưởng tơ nấm trên môi trường 2 nhằm mục đích tìm kiếm môi trường nhân giống tối ưu hóa nhất cho 2 loài khảo sát chính là
Khi quá trình khảo sát kết thúc, chúng tôi thấy rằng tốc độ lan tơ của 3 đối tượng trên môi trường 2 chậm hơn tốc độ lan của chúng trên môi trường 1, tuy nhiên sự chênh lệch này không nhiều.
Về mặt hình thái:
- Linh Chi chuẩn G.lucidum có hình thái giống như hình thái của nó trên môi trường 1
- Trong khi đó, G.sp có tơ nấm mảnh hơn, có sự phân nhánh nhiều hơn, tơ vươn dài lên cả mặt trên và thành đĩa (dù không có thạch), tơ nấm có màu trắng nhạt.
- Tơ nấm của G.neo-japonicum lúc đầu bện chặt, tơ nấm vươn đến đâu lại bện chặt ngay đến đó, về sau, tơ có hiện tiện mảnh và thưa dần, tơ bắt đầu có sự ngả màu từ trắng sang trắng xỉn, trắng hơi vàng, vàng.
So với môi trường 1, thì tơ nấm của 2 đối tượng khảo sát chính trên môi trường 2 bện chặt và khỏe hơn cũng nhiên tơ nhanh già hơn
3.2.3. Tốc độ tăng trưởng và đặc điểm tơ nấm ở 3 đối tượng: Ganoderma