A. Ống chuẩn chứa dung dịch NaOH; B. Ống chuẩn chứa dung dịch HCl (Hãng sản xuất Merck (Đức))
Hình 2.5. Bộ hóa chất dùng để pha mơi trường Hanks
2.2.4. Thức ăn cho cá
Trong điều kiện nuôi trong bể, thức ăn của cá Ngựa vằn bao gồm thức ăn tổng hợp, Bo bo và rong.
28
Hình 2.6. Thức ăn tổng hợp dạng bột dành cho cá
- Bo bo (trứng nước, bọ đỏ, hồng trần, rận nước)
Bo bo chứa lượng protein lớn, 50% khối lượng khơ của cơ thể, ngồi ra, ở Bo bo trưởng thành, lượng chất béo chiếm tới 20 - 27% khối lượng khơ [21]. Do đó, nó là nguồn thức ăn bổ dưỡng cho cá thời kì phát triển mạnh và thời kì sinh sản.
A B (X4)
Hình 2.7. Bo bo
(A - Màu sắc của bo bo trong điều kiện thường; B - Cận cảnh hình thái của bo bo) - Rong:
Loại rong được sử dụng thuộc họ Rong đi chó (Ceratophyllaceae), chi
Ceratophyllum. Ngồi việc chúng có thể làm thức ăn cho cá, chúng cịn tiết ra các
chất độc đối với các lồi tảo, giúp ngăn cản một cách có hiệu quả sự phát triển của tảo [24]. Chúng cịn có khả năng tạo nhiều oxy nhờ q trình quang hợp.
29
A B
Hình 2.8. Rong đi chó
(A - Cây rong đặt trong becher 1 lít; B - Cận cảnh một phần của cây rong)
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Bố trí thí nghiệm
Tồn bộ thí nghiệm trong đề tài được bố trí theo sơ đồ hình 2.9. Mỗi nồng độ khảo sát chọn 30 cá bột (1 tuần tuổi), lặp lại 3 lần. Tiến hành kiểm tra số lượng cá sống, chiều dài, cân nặng. Các lần kiểm tra kế tiếp được thực hiện theo chu kì 7 ngày một lần.
30
Ấu trùng (7 ngày tuổi) lô ĐC
Ấu trùng (7 ngày tuổi) nhiễm chì các nồng độ
Chuyển vào bể ni (0 µg/l)
Chuyển vào bể ni (20 µg/l, 40 µg/l, 60 µg/l, 80 µg/l)
Chăm sóc, theo dõi tỉ lệ sống chết, sự sinh trưởng phát triển
Thu cá
Sau 18 tuần
Tách cơ, xương, nội tạng
Phân tích mẫu
31
2.3.2. Chuẩn bị mơi trường ni cá
Môi trường được sử dụng để nuôi cá là môi trường Hanks.
2.3.2.1. Chuẩn bị môi trường Hanks
Môi trường được chọn để ni cá trong thí nghiệm này là mơi trường Hanks, với những nguyên nhân sau:
(1) nếu sử dụng nước máy: khó kiểm sốt được thành phần các chất có trong nước máy, độ pH không đồng nhất, ngay cả khi đã được sục khí để khử clo. Điều này gây ảnh hưởng đến kết quả phân tích.
(2) nếu sử dụng nước cất: trong nước cất, hầu như chỉ có một thành phần duy nhất là “nước”. Trong khi đó, cá chỉ sinh trưởng tốt khi mơi trường sống có một số ion nhất định. Trong trường hợp bổ sung muối biển vào nước cất để nuôi cá cũng khơng kiểm sốt được các thơng số và thành phần trong môi trường.
(3) môi trường Hanks được xây dựng dựa trên những nhu cầu thiết yếu nhất của cá (hay động vật nói chung); tạo mơi trường có thành phần các ion, khoáng chất, độ pH phù hợp để cá sinh trưởng và phát triển.
Có thể pha môi trường Hanks một cách nhanh chóng từ những dung dịch Stock đã chuẩn bị trước.
Chuẩn bị dung dịch Stock
o Dung dịch Hanks Stock
Các dung dịch Hanks Stock được pha sẵn (công thức: xem phụ lục 1) và bảo quản trong lọ nhỏ bằng thủy tinh để hạn chế biến tính hóa chất và tiện sử dụng.
32
Hình 2.10. Các lọ dung dịch Stock
Dung dịch Stock #1, #2, #4, #5 có thể bảo quản nhiệt độ phòng trong 2 - 3 tuần, bảo quản trong nhiệt độ lạnh (tủ lạnh) trong vài tháng. Riêng Stock #6 có thành phần là NaHCO3 (sodium bicarbonate) không thể bảo quản lâu. Để Stock #6 giữ được đặc tính của nó, ta nên pha nó ngay khi cần sử dụng hoặc không để lâu quá một tuần.
o Dung dịch Stock chì
Để thuận tiện cho việc pha mơi trường nhiễm chì với các nồng độ khác nhau, ta chuẩn bị sẵn các Stock chì.
Stock chì được pha từ Pb(NO3)2 (tinh thể); ta có thể phân biệt thành Stock A - Stock mẹ; và Stock B - Stock con.
Stock A (1g Pb/ 1L dd) : pha 0,15985g Pb(NO3)2 vào 100 mL nước cất (công thức: xem phụ lục 1).
Stock B (Stock A pha loãng 100 lần): hút lấy 1 mL Stock A pha với 99 mL nước cất.
Pha môi trường
33
- 10 mL Final Hanks (xem phụ lục 1) - 90 mL nước cất.
Sau khi đã pha xong môi trường Hanks, tiến hành chuẩn độ pH để tạo điều kiện sống tốt cho cá. cá Ngựa vằn thích hợp với pH khoảng 7,2.
Dụng cụ chuẩn độ là máy đo pH, pipetman. Dung dịch chuẩn độ là HCl và NaOH (xem phần 2.2.)
Thí nghiệm tiến hành trên các nồng độ (khối lượng chì/ thể tích mơi trường) như sau: 0 μg/L, 20 μg/L, 40 μg/L, 60 μg/L, 80 μg/L.
Bảng 2.4. Công thức pha môi trường ni cá với các nồng độ chì khảo sát NỒNG ĐỘ NỒNG ĐỘ
mPb/Vdd (µg/L)
CƠNG THỨC CHO 1L MÔI TRƯỜNG NUÔI CÁ
0 1 l môi trường Hanks
20 2 mL Stock B + 998 mL môi trường Hanks 40 4 mL Stock B + 996 mL môi trường Hanks 60 6 mL Stock B + 994 mL môi trường Hanks 80 8 mL Stock B + 992 mL môi trường Hanks
2.3.2.2. Chuẩn bị bể nuôi
Bố trí bể ni
Bể ni cá là bể thủy tinh chun dụng có kích thước 17cm x 18cm x 29cm, để tránh lãng phí, mỗi bể sẽ chứa khoảng 2 lít mơi trường Hanks. Pha Stock B của chì vào từng bể ni (đã có sẵn mơi trường Hanks) theo công thức bảng 2.4.
Để tạo nơi ẩn nấp cho cá, ta bỏ thêm rong vào bể ni. Ngồi ra, nhờ q trình quang hợp, rong cịn cung cấp thêm O2 cho môi trường sống của cá. Sử dụng máy sục khí cho mơi trường ni cá. Khi cá cịn nhỏ, nên sục khí ở mức nhẹ, tránh làm cá bị sốc do môi trường dao động liên tục (trên máy sục, có nút điều chỉnh hai cấp độ sục mạnh và yếu).
34
Các bể nuôi được đặt trong điều kiện ánh sáng đầy đủ. Khơng có sự chênh lệch về nhiệt độ, ánh sáng giữa các bể. Bên ngồi bể có dán nhãn ghi rõ các thông số cần thiết (ngày thu phơi, nồng độ chì trong mơi trường).
Hình 2.11. Bố trí bể ni cá
Chuyển cá bột sang môi trường mới
Nguồn cung cấp cá là cá đã được nhiễm chì các nồng độ tương ứng từ giai đoạn phôi. Số cá này đạt 7 ngày tuổi tính từ sau ngày thu phơi.
Trong giai đoạn 7 ngày tuổi, cá bột còn tương đối khỏe mạnh. Mặc khác, để hạn chế sự xáo trộn môi trường nhiều lần dễ gây ảnh hưởng đến cá, ta tiến hành chuyển cá từ môi trường Hanks phôi (từ sau khi thu phôi cho đến 7 ngày tuổi, cá được giữ trong môi trường Hanks phôi) sang môi trường Hanks theo cách sau:
Bước 1: Chuẩn bị sẵn bể ni cá cùng hệ thống sục khí, mơi trường Hanks với các nồng độ tương ứng.
Bước 2: Rút bỏ môi trường Hanks phôi
- Trong tuần tuổi đầu tiên, cá bột được nuôi trong môi trường Hanks phôi, giữ trong các cốc becher (dung tích 1 lít).
35
- Dùng ống nhựa, mềm đường kính bên trong là 3 mm để rút bỏ từ từ môi trường Hanks phôi khỏi becher. Lưu ý: giữ lại một lượng môi trường trong becher cho cá bột.
Bước 3: Dùng tay cầm cả becher (trong đó có cá bột và một lượng mơi trường Hanks phơi) để chuyển tồn bộ cá và mơi trường còn lại vào bể lớn.
2.3.3. Phương pháp nuôi cá
Để tạo điều kiện sống tốt nhất cho cá, trong q trình chăm sóc, cần chú ý những yêu cầu sau:
Thay nước:
Tiến hành thay nước cho bể cá hàng tuần. Đôi khi trong bể xuất hiện những chấm màu trắng, hay màu nước đục bất thường (trong bể ni cá thường có màu vàng nhạt do rong và những chất bẩn cho cá bài tiết); cần thay nước thường xuyên hơn (2 - 3 ngày) do có thể bể nước bị nhiễm khuẩn.
Cách thay nước:
Bước 1: Pha sẵn môi trường Hanks vào các becher 1 lít. Chuẩn độ pH bằng dung dịch chuẩn HCl và NaOH, đưa về giá trị 7,2.
Bước 2: Cho đầy nước vào ống nhựa. Một đầu ống tiếp xúc với môi trường nước trong bể. Đầu còn lại đặt vào cốc chứa nước bẩn, đặt thấp hơn so với mực nước trong bể. Nước trong bể sẽ được dẫn vào cốc chứa nước bẩn, nhờ vào lực mao dẫn và thế năng.
Bước 3: Di chuyển nhẹ nhàng đầu ống để hút sạch vụn bã do rong phân hủy, phân cá, thức ăn thừa hay các sinh vật lạ trong bể. Chú ý tránh gây ảnh hưởng đến cá.
Bước 4: Sau khi đã hút sạch chất bẩn và nước giảm khoảng 1/3 so với lượng nước ban đầu, tiến hành dẫn môi trường Hanks (đã pha sẵn, nồng độ chì tương ứng)
36
vào bể theo nguyên tắc mao dẫn. Lúc này, cốc đựng môi trường Hanks đặt cao hơn so với bể.
Cho ăn:
Cho cá ăn 2 - 3 lần/ ngày. Lượng thức ăn vừa phải, đảm bảo cá ăn hết trong vòng 5 phút để tránh gây nhiễm bẩn môi trường do thức ăn thừa.
2.3.4. Phương pháp theo dõi sinh trưởng của cá, thu mẫu và tách mẫu cá
2.3.4.1. Theo dõi sinh trưởng của cá
- Theo dõi khả năng sống của cá: thống kê tỉ lệ sống chết của cá trong từng bể, khoảng cách giữa các lần thống kê là 1 tuần.
- Theo dõi sự phát triển chiều dài của cá: Khoảng cách giữa các lần đo là 1 tuần.
2.3.4.2. Thu mẫu và tách mẫu cá
Sau khi cá đã đạt kích thước nhất định, tiến hành thu mẫu và tách mẫu cá. Các bước tiến hành như sau:
Chuẩn bị:
Chuẩn bị bộ dùng cụ mổ: dao, kéo, kẹp sạch.
Chuẩn bị eppendorf, ghi nhãn cho từng eppendorf (số thứ tự, ngày, lô, mẫu).
Cân khối lượng ban đầu của từng eppendorf.
Tiến hành:
Bước 1: Vớt cá.
Bước 2: Dùng giấy thấm thấm sạch nước bên ngoài cá. Đo các chỉ tiêu về chiều dài và cân nặng của từng con (hình 2.12).
37
Bước 3: Dùng kéo và kẹp, tách đầu cá
Bước 4: Dùng kéo, cắt dọc cơ phần bụng cá, tách nội tạng.
Bước 5: Dùng dao giải phẫu, kẹp tách riêng phần cơ và xương cá (hình 2.13). Bước 6: Đầu và xương đặt vào eppendorf thứ nhất, nội tạng đặt vào eppendorf thứ hai, cơ đặt vào eppendorf thứ ba.
Bước 7: Cân lại khối lượng của từng eppendorf.
A B
Hình 2.12. Đo các chỉ tiêu chiều dài (hình A) và cân nặng (hình B) của cá Ngựa vằn
38
Sau khi tách mẫu, tiến hành gửi mẫu cá đến Công ty Cổ phần Dịch vụ Khoa học công nghệ Sắc ký Hải Đăng, số 79 Trương Định, Quận 1, Tp. Hồ Chí Minh để phân tích nồng độ chì tích lũy trong từng phần: cơ, xương - đầu, nội quan.
2.3.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
Phần mềm xử lý số liệu: Excel - Microsoft Office 2010; Sigma Plot 11.0 Phương pháp xử lý số liệu:
- Phương pháp phân tích phương sai một nhân tố: ANOVA - One Way. - Phương pháp kiểm tra mức độ tương quan và vẽ tuyến tính.
- Phương pháp kiểm tra các nhóm dữ kiện: Tukey và Holm - Sidak.
Phương pháp kiểm tra Tukey: Phương pháp này được sử dụng cho tất cả các so sánh giá trị trung bình của các cặp trong nhóm.
Phương pháp Holm - Sidak: Phương pháp kiểm tra này có thể sử dụng được cho cả trường hợp so sánh giữa các cặp và so sánh với nhóm đối chứng (ĐC). Nó mạnh hơn so với các phương pháp kiểm tra khác (ví dụ như Tukey và Boferroni) và được khuyến cáo sử dụng cho các phép kiểm tra so sánh nhiều nhóm (nguồn: Sigma Plot).
39
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. TỈ LỆ SỐNG CỦA CÁ NGỰA VẰN Ở CÁC NỒNG ĐỘ KHÁC NHAU
Sau khi nhận cá bột đã nhiễm chì ở giai đoạn phơi, tiến hành theo dõi tỉ lệ cá sống sau từng tuần và thu được kết quả ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tỉ lệ sống của cá Ngựa vằn từ tuần 1 - tuần 18 ở các nồng độ khảo sát khảo sát THỜI GIAN ĐC 20 µg/L 40 µg/L 60 µg/L 80 µg/L Nhập cá 100,00% (90 con) 100,00% (90 con) 100,00% (90 con) 100,00% (90 con) 100,00% (90 con) Sau 1 tuần 16,67% (15 con) 14,44% (13 con) 11,11% (10 con) 16,67% (15 con) 6,67% (6 con) Sau 2 tuần 16,67% (15 con) 10,00% (9 con) 8,89% (8 con) 12,22% (11 con) 5,56% (5 con) Sau 3 tuần 15,56% (14 con) 10,00% (9 con) 8,89% (8 con) 7,78% (7 con) 3,33% (3 con) Sau 4 tuần 15,56% (14 con) 8,89% (8 con) 8,89% (8 con) 7,78% (7 con) 3,33% (3 con) Sau 5 tuần 15,56% 8,89% 8,89% 7,78% 3,33% Sau 6 tuần 15,56% 8,89% 8,89% 7,78% 3,33% Sau 7 tuần 15,56% 8,89% 8,89% 7,78% 3,33% Sau 8 tuần 15,56% 8,89% 8,89% 7,78% 3,33% Sau 14 tuần 15,56% 8,89% 8,89% 7,78% 3,33% Sau 18 tuần 15,56% 8,89% 8,89% 7,78% 3,33%
Tỉ lệ cá sống qua các tuần ở các nồng độ khác nhau được mô tả trực quan bằng đồ thị sau:
40
Hình 3.1. Đồ thị thể hiện tỉ lệ cá sống theo thời gian ở các nồng độ khảo sát
Nếu coi số cá ban đầu chuyển vào bể ni là 100% thì sau 1 tuần, số lượng cá giảm rất nhiều và đột ngột. Ở thời điểm này, tỉ lệ sống chỉ còn từ 6 - 17% trong các lơ thí nghiệm. Điều này có thể lí giải bởi một số lí do sau:
(i) ở giai đoạn phơi và ấu trùng mới thốt nang, trên cơ thể cá vẫn mang túi nỗn hồng (yolk) chứa chất dinh dưỡng để cung cấp cho cá; khi cá đạt 7 đến 10 ngày tuổi, túi noãn hoàng dần dần tiêu biến, lúc này cá con phải tự tìm nguồn dinh dưỡng bên ngoài. Đây là giai đoạn chuyển biến quan trọng địi hỏi sự thích nghi cao. Mặt khác, trong điều kiện môi trường sống nhân tạo, nguồn thức ăn vi sinh hạn chế hơn so với môi trường tự nhiên.
0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 … 18 Tỉ lệ c á sống
Thời gian khảo sát (tuần)
Đối chứng 20 µg/l 40 µg/l 60 µg/l 80 µg/l
41
(ii) cá con vừa được chuyển từ môi trường Hanks phôi sang môi trường Hanks dành cho cá trưởng thành nên có sự thay đổi một số chỉ tiêu về môi trường (nhiệt độ, nồng độ các ion), các yếu tố này có thể đã ảnh hưởng đến sức sống của cá. (iii) cá con kích thước nhỏ khơng thể sử dụng nguồn thức ăn có kích thước lớn so với cơ thể chúng, như thức ăn tổng hợp, Bo bo.
Từ kết quả bảng 3.1 và hình 3.1, cho thấy tỉ lệ sống của cá sau tuần đầu giảm tuyến tính ở nồng độ 0, 20, 40 và 80 µg/L. Điều này cho thấy sự ảnh hưởng của nồng độ chì lên sự phát triển của cá rõ rệt: nồng độ càng tăng, tỉ lệ sống của cá càng giảm. Kết quả này cũng phù hợp với lí thuyết, cho rằng nồng độ chì cho phép trong nước mặt là 0,02 mg/L [4]. Riêng ở nồng độ 60 µg/L có giảm nhưng phi tuyến tính so với các nồng độ còn lại (tỉ lệ sống cao hơn so với ở nồng độ 40 µg/L, 16,67% so với 11,11%, tương ứng). Điều này có thể là do những sai sót trong thao tác thí nghiệm, do mơi trường bị nhiễm bẩn từ thức ăn…
Số lượng cá trong tuần thứ hai giảm nhẹ và không đồng đều ở các nồng độ. Tỉ lệ sống của cá trong tuần này cũng giảm tuyến tính ở nồng độ 0, 20, 40 và 80 µg/L. Riêng ở nồng độ 60 µg/L có giảm nhưng phi tuyến tính so với các nồng độ cịn lại (tỉ lệ sống cao hơn so với ở nồng độ 40 µg/L, 12,22% so với 8,89%, tương ứng). Điều này cũng được giải thích tương tự như trên. Tuy nhiên, ở tuần thứ ba và thứ tư có sự chuyển biến ở nồng độ 60 µg/L. Ở thời gian này, tỉ lệ sống của cá giảm nhẹ và giảm tuyến tính ở tất cả các nồng độ khảo sát; đồng thời tỉ lệ sống này được duy trì ổn định cho đến thời điểm thu nhận cá để đi phân tích (sau 18 tuần). Như vậy, bước qua tuần thứ tư, các yếu tố về thức ăn, môi trường sống đã đi vào trạng thái ổn định và cá đã thích nghi. Nếu tiến hành khảo sát từ tuần thứ hai trở đi để giảm ảnh hưởng của yếu tố ngẫu nhiên đến kết quả thí nghiệm và xem số cá lúc này là 100%, ta có kết quả bảng 3.2.
42
Bảng 3.2. Tỉ lệ sống của cá Ngựa vằn từ tuần 2 - tuần 18 ở các nồng độ khảo sát khảo sát THỜI GIAN (TUẦN) ĐC 20 µg/L 40 µg/L 60 µg/L 80 µg/L