4. Ý nghĩa thực tiễn
4.1.1 Sự thay ñổi hình thái trong quá trình tạo sẹo
Dưới tác ñộng của auxin là 2,4–D hay AIA không kết hợp hoặc kết hợp với BA, các tế bào dưới biểu bì ở cả mặt trên và mặt dưới dọc theo gân lá, các tế bào lớp mỏng ñốt tử diệp, tử diệp, trụ hạ diệp ñều có dấu hiệu phản phân hóa và bắt ñầu phân chia mạnh mẽ ñể hình thành mô sẹo. Các tế bào ở các lớp mỏng của các nguồn mẫu tiếp xúc trực tiếp với môi trường ñược cảm ứng bởi chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh trước tiên nên mô sẹo ñược hình thành sớm và tăng sinh nhanh. Ở tuần thứ 2, các tế bào mô sẹo ở phía ngoài tách rời nhau làm mô sẹo trở nên xốp. Lúc này, các tế bào mô sẹo phía ngoài có dạng hình thay ñổi, chứa không bào to khác với tế bào phía bên trong có kích thước ñều nhau, tế bào chất ñậm ñặc, nhân to (những tế bào có thể phát sinh hinh thái) [8]. Các nhóm tế bào này tiếp tục duy trì sự phân chia và có tế bào chuyển dần sang nâu ở tuần thứ 4 và thứ 5 (ảnh 3.9).
4.1.2 Các biến ñổi sinh lý trong quá trình hình thành mô sẹo
Trong giai ñoạn hình thành mô sẹo, dưới tác ñộng của 2,4-D hay AIA có hoặc không có kết hợp với BA ñến khả năng phân chia của mô sẹo. Ở tế bào, auxin kích thích hoạt ñộng bơm proton của màng nguyên sinh chất, giúp H+ ñược bơm ra vách tế bào làm pH của vách giảm xuống. Sự hạ thấp pH ở vách cần thiết cho sự gỡ liên kết giữa các vi sợi cellulose và hoạt hóa hoạt ñộng của một số enzyme thủy giải protein của vách làm vách trở nên lỏng lẻo [11]. Vì vậy ở tuần thứ 2, dưới tác ñộng của 2,4-D hay AIA, các tế bào mô sẹo ở lớp ngoài cùng có xu hướng tách rời nhau. Bên cạnh ñó, có lẽ hoạt tính AIA nội sinh cao trong mô sẹo ñã kích thích các tế bào phân chia mạnh mẽ.
Cường ñộ hô hấp (CĐHH) thể hiện nhu cầu năng lượng trong quá trình phân chia tế bào, các tế bào ñang phân chia có cường ñộ hô hấp cao hơn các tế bào ñang phân hóa [8]. Những nghiệm thức có kết hợp với BA có CĐHH tăng ở tuần thứ 2, tăng mạnh ở tuần thứ 3 kéo dài thời gian phân chia hơn so với những nghiệm thức chỉ có 2,4-D có CĐHH tăng mạnh ở tuần 2 nhưng bắt ñầu giảm ở
tuần thứ 3. Do ñó, sự gia tăng trọng lượng tươi, gia tăng trọng lượng khô cũng cao hơn ở các nghiệm thức có kết hợp với BA. Sự giảm trọng lượng tươi, trọng lượng khô, CĐHH cũng theo sự giảm nồng ñộ auxin (2,4-D, AIA) và cytokinin (BA) ngoại sinh. Vì vậy, có thể sự giảm hô hấp của mô sẹo theo thời gian thể hiện sự giảm dần hoạt tính của auxin (2,4-D, AIA) và cytokinin (BA) trong môi trường nuôi cấy (bảng 3.2, 3.3, 3.4, 3.5; hình 3.2, 3.2, 3.4, 3.5, 3.6).
Trong các nguồn mẫu nuôi cấy, lớp mỏng ñốt tử diệp cho mô sẹo tốt nhất. Có lẽ, ngoài ảnh hưởng của chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh, nồng ñộ AIA nội sinh cao do từ lá tổng hợp ñưa xuống, từ hai tử diệp ñi ra và BA nội sinh từ rễ tổng hợp ñi lên nên tập trung nhiều hơn ở ñốt tử diệp so với các nguồn mẫu khác.
Trên môi trường không bổ sung chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật, tất cả các nguồn mẫu là lá, lớp mỏng ñốt tử diệp, lớp mỏng tử diệp, lớp mỏng trụ hạ diệp ñều xuất hiện rễ. Có thể nồng ñộ AIA nội sinh ở các nguồn mẫu cao ñủ ñể kích hoạt sự tạo rễ.
Trong tất cả các nguồn mẫu ñều có chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh. Khi bổ sung chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh, các nguồn mẫu có sự ñáp ứng khác nhau dẫn ñến sự khác biệt về trạng thái, trọng lượng tươi, trọng lượng khô và hô hấp của mô sẹo giữa các loại mẫu cấy. 2,4-D là một auxin tổng hợp mạnh. Đáp ứng của auxin rất thay ñổi ở các nguồn mẫu. Thông thường, trong môi trường nuôi cấy có bổ sung 2,4-D cho mô sẹo xốp và tạo rễ [8].
4.2 Sự phát sinh chồi từ mô sẹo của cây mướp ñắng 4.2.1 Sự thay ñổi hình thái trong sự phát sinh chồi 4.2.1 Sự thay ñổi hình thái trong sự phát sinh chồi
Một tuần sau khi chuyển mô sẹo sang môi trường MS cơ bản và môi trường MS có bổ sung BA hoặc BA kết hợp với AIA, các tế bào ñẳng kính, tế bào chất ñậm ñặc, nhân to là những tê bào tiềm năng (competant cells) từ mô sẹo bắt ñầu phân chia hình thành nên một ñám tế bào gắn kết với nhau hình thành nên những nốt phát triển ñộc lập có màu xanh. Bên trong các nốt này
phân hóa hình thành nên các sơ khởi chồi. Cuối cùng, các sơ khởi chồi có sự phân hóa hình thành nên chồi hoàn chỉnh ñược bảo vệ bằng các phát thể lá.Tuy nhiên, với môi trường ñược bổ sung chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật, các nốt (phát thể chồi) nhiều hơn (ảnh 3.10, 3.11, 3.12, 3.13).
Ở các mô sẹo ñược hình thành trên môi trường có nguồn auxin là AIA, các nốt ñều tạo chồi. Trong khi ở các mô sẹo ñược hình thành trên môi trường có nguồn auxin là 2,4-D, các nốt duy trì lâu ở trạng thái hình cầu, không có sự phân hóa thành chồi. Có lẽ 2,4-D vẫn còn tồn tại trong khối mô sẹo ñã thúc ñẩy sự phân chia của tế bào, cản sự phân hóa tạo chồi. Do ñó, các tế bào vẫn tiếp tục phân chia ñể hình thành mô sẹo.
4.2.3 Các biến ñổi sinh lý trong quá trình phát sinh chồi
Khi thời gian nuôi cấy ñủ dài ñể giảm dần tác ñộng của auxin, mô sẹo sẽ chậm phân chia và dễ dàng phân hóa hơn [11]. Do ñó, mô sẹo 3 tuần tuổi có thể tạo chồi khi chuyển sang môi trường tạo chồi. Tuy nhiên, ñối với mô sẹo ñược hình thành trên môi trường có nguồn auxin là 2,4-D, mô sẹo 3 hay 4 tuần tuổi ñều không thể tạo chồi. Sự tác ñộng của các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật trong quá trình phát sinh hình thái phụ thuộc rất nhiều vào kiểu mô, trạng thái sinh lý, bản chất và nồng ñộ của các chất sử dụng cũng như sự phối hợp giữa các chất [11],[18]. Như vậy, ñối với mô sẹo của cây mướp ñắng ñược hình thành do sự cảm ứng bởi 2,4-D có thể bị ngăn cản sự tạo chồi mặc dù có sự giảm dần hoạt tính của 2,4-D theo thời gian nuôi cấy nhưng vẫn còn tồn tại một lượng nhỏ trong mô sẹo.
Trong khi ñó, mô sẹo ñược hình thành trên môi trường có nguồn auxin là AIA vẫn tạo thành chồi khi chuyển sang môi trường tạo chồi. AIA là loại auxin dễ bị phân hủy theo thời gian. Thông thường, hoạt ñộng của các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật sẽ hiệu quả hơn khi có sự phối hợp, phụ thuộc vào tỷ lệ chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật. Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin nghiêng về auxin, sẽ có sự hình thành rễ. Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin nghiêng về cytokinin, sẽ có sự hình thành
chồi[18][7]. Vì vậy, khi có sự kết hợp giữa BA từ 0,2 – 3mg/l và AIA 0,02 mg/l, chồi ñược hình thành nhiều hơn (bảng 3.7).
4.3 Sự phát sinh rễ từ chồi mướp ñắng
4.3.1 Ảnh hưởng của AIA trong sự phát sinh rễ
Auxin cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào nên có vai trò quan trọng sự phát sinh hình thái thực vật. Auxin kích thích tạo rễ [4].
AIA với nồng ñộ thay ñổi từ 0,2 – 1,5mg/l ñều kích thích sự phát sinh rễ. Môi trường không bổ sung AIA cũng kích thích sự tạo rễ. Như vậy, nồng ñộ AIA nội sinh trong chồi cao, ñủ ñể kích thích sự hình thành rễ. Trong quá trình xử lý auxin, nếu xử lý với nồng ñộ tối hảo ñối với thực vật sẽ có tác dụng kích thích sự tăng trưởng. Ngược lại, ở nồng ñộ cao sẽ ức chế sự tăng trưởng và có thể trở thành ñộc tố [7],[15]. Vì vậy, ñối với chồi mướp ñắng, AIA ở nồng ñộ 0,2 – 0,5 mg/l kích thích mạnh sự ra rễ, còn các nồng ñộ cao hơn như 1 và 1,5mg/l ức chế sự phát triển rễ, số rễ ít và rễ ngắn, ñồng thời cảm ứng sự tạo và tăng trưởng mô sẹo quanh vết cắt (bảng 3.8, ảnh 3.14).
4.3.2 Sự thay ñổi hình thái trong quá trình phát sinh rễ
Rễ bất ñịnh ñược phân hóa từ các tế bào phía trong nội bì (nhu mô: libe, mộc, tủy) hay tượng tầng libe-mộc ñều có thể họat ñộng ñể cho sinh mô rễ (nguồn gốc nội sinh). Tại ñây, chúng ñược tạo nên từ ñám tế bào sơ khởi xuất phát từ sự khử phân hóa các mô ñã phân hóa, hồi phục trở lại thời kỳ phôi, hoạt ñộng như một sinh mô. Các nghiên cứu cho thấy, sự tạo rễ bất ñịnh gồm 2 giai ñoạn: giai ñoạn 1, bao gồm sự tạo nhóm tế bào ñể hình thành sơ khởi rễ và giai ñoạn 2, sự kéo dài các sơ khởi rễ ñể tạo thành rễ bất ñịnh. Cả hai giai ñoạn ñều có sự tham gia của auxin [4].
Sự tạo rễ bất ñịnh ở cây mướp ñắng cũng trải qua 2 giai ñoạn trên. Tại tượng tầng libe-mộc, các tế bào phân chia mạnh và tạo nên sơ khởi rễ, các sơ khởi này tiếp tục kéo dài và có cấu trúc hoàn chỉnh trước khi xuyên qua vùng vỏ và lớp biểu bì (ảnh 3.15).
4.3.3 Các biến ñổi sinh lý trong quá trình phát sinh rễ
Trên môi trường không bổ sung AIA ngoại sinh, hoạt tính AIA nội sinh trong chồi ñủ ñể kích thích sự hình thành rễ bất ñịnh, nhưng số lượng rễ rất ít. Các auxin ngoại sinh với nồng ñộ thích hợp ñã ñược chứng minh có tác ñộng kích thích sự hình thành rễ bất ñịnh và tăng tích lũy AIA nội sinh trong suốt quá trình hình thành rễ [11]. Khi bổ sung thêm AIA ngoại sinh, số lượng rễ tăng lên nhiều và rễ ñược hình thành sớm hơn (bảng 3.8). Do ñó, chính việc bổ sung AIA vào môi trường tạo rễ, giúp gia tăng tích lũy AIA nội sinh trong mẫu cấy. Từ ñó ñã kích thích quá trình khử phân hóa của các tế bào tượng tầng libe – mộc ñể trở về trạng thái sinh mô.
Ngoài ra, dưới tác ñộng của cytokinin nội sinh, các nhóm tế bào ñã ñược cảm ứng bởi AIA sẽ có hoạt tính phân chia mạnh ñể tạo sơ khởi rễ. Sự giảm dần hoat tính AIA theo thời gian tạo ñiều kiện thuận lợi cho sự kéo dài của các sơ khởi rễ [7],[4].
4.4 Sự thích ứng của cây con in vitro ngoài vườn ươm
Khi ñưa ra vườn ươm, tỷ lệ cây sống tương ñối thấp (73,33%). Trong in
vitro, cây sống ở ñiều kiện có ñộ ẩm cao, nhiều chất dinh dưỡng, khí khổng luôn
mở nên khi ñưa ra vườn ươm, cây chưa thích ứng tốt, rất dễ mất nước, rễ mới chưa hình thành nên việc hấp thu nước và chất khoáng gặp nhiều trở ngại, cây chết bị héo lá. Những cây có bộ rễ tốt thường có khả năng sống tốt và tăng trưởng tốt hơn.
KẾT LUẬN
- Dung dịch thủy ngân chlorite nồng ñộ 0,1%, thời gian xử lý 10 - 15 phút và calcium hypochlorite 15% với thời gian khử trùng 20 phút cho tỷ lệ mẫu sạch và sống cao nhất (90,00 – 93,33%).
- Trong các nguồn mẫu nuôi cấy từ cây mướp ñắng, mô sẹo ñược hình thành từ lớp mỏng ñốt tử diệp trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l kết hợp với BA 1mg/l là tốt nhất.
- Về sự tạo chồi từ mô sẹo mướp ñắng, môi trường MS có bổ sung BA 0,5mg/l kết hợp với AIA 0,02 mg/l cho tỷ lệ chồi và số chồi nhiều nhất. Không có sự hình thành chồi từ mô sẹo ñược cảm ứng bởi môi trường có nguồn auxin là 2,4-D.
- AIA kích thích mạnh sự phát sinh rễ. Trong ñó, môi trường MS có bổ sung AIA 0,2mg/l cho số rễ nhiều nhất, và rễ phát triển tốt nhất.
- Khi ñưa ra vườn ươm, cây mướp ñắng sống và tăng trưởng tốt, tỷ lệ cây sống 73,33%. Những cây con chết chủ yếu do mất nước.
ĐỀ NGHỊ
- Cần khảo sát thêm các nồng ñộ chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật khác ñể cho sự phát triển chồi tốt nhất từ mô sẹo.
- Tìm hiểu sự tạo các hợp chất thứ cấp trong quá trình hình thành mô sẹo và phát sinh hinh thái. Từ ñó tìm ra mối liên hệ giữa sự hình thành các hợp chất thứ cấp, sự tạo mô sẹo và sự phát sinh hinh thái ở cấy mướp ñắng.
Môi trường MS (Murashige and skoog 1962) Khoáng ña lượng mg/lít
KNO3 1900 NH4NO3 1650 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 Khoáng vi lượng µg/l MnSO4.4H2O 22300 ZnSO4.7H2O 8600 H3BO3 6200 KI 830 CuSO4.5H2O 25 Na2MoO4.2H2O 250 CoCl2.6H2O 25 FeSO4.7H2O 27850 Na2EDTA. 2H2O 37250 . Vitamin mg/l Inositol 100 mg/l Thiamine HCl 0,1 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine HCl 0,5
Nồng ñộ Javel:nước
Thời gian xử lý (phút) Tỷ lệ % mẫu sạch
1:0 10 80,33± 0.58abc 1:0 15 83,33 ±0.88abc 1:0 20 86,67 ± 0.88bc 1:1 10 66,67± 0.58a 1:1 15 70,00 ±0.58ab 1:1 20 71,00 ±0.58ab Calcium hypochlorite
Nồng ñộ Thời gian xử lý (phút) Tỷ lệ % mẫu sạch
5% 10 66,67 ± 0.33a 5% 15 66,67 ± 0.67a 5% 20 76,67 ± 0.33abc 10% 10 76,67 ± 0.33abc 10% 15 80,00 ± 0.58abc 10% 20 76,67 ± 0.33abc 15% 10 86.67 ± 0.33bc 15% 15 80,00 ± 0.58abc 15% 20 90,00 ± 0.58c
Thủy ngân chlorite
Thời gian xử lý (phút) Tỷ lệ % mẫu sạch
5 86,67 ± 0.67bc
10 90,00 ± 0.58c
ANOVA TRONGLUONGTUOI Sum of Squares df Mean Square F Sig.
TUAN0 Between Groups (Combined) .000 11 .000 .218 .994
Linear Term Contrast .000 1 .000 .897 .353
Deviation .000 10 .000 .150 .998
Within Groups .000 24 .000
Total .000 35
TUAN2 Between Groups (Combined) .812 11 .074 22.430 .000
Linear Term Contrast .113 1 .113 34.214 .000
Deviation .699 10 .070 21.252 .000
Within Groups .079 24 .003
Total .891 35
TUAN3 Between Groups (Combined) 1.552 11 .141 45.501 .000
Linear Term Contrast .157 1 .157 50.562 .000
Deviation 1.395 10 .140 44.995 .000
Within Groups .074 24 .003
Total 1.626 35
TUAN4 Between Groups (Combined) 2.485 11 .226 91.151 .000
Linear Term Contrast .046 1 .046 18.518 .000
Deviation 2.439 10 .244 98.415 .000
Within Groups .059 24 .002
Total 2.545 35
TUAN5 Between Groups (Combined)
2.984 11 .271 134.66
3 .000
Linear Term Contrast .042 1 .042 20.800 .000
Deviation
2.942 10 .294 146.05
0 .000
Within Groups .048 24 .002
TRONGLUONGTUOI
Sum of
Squares df Mean Square F Sig.
TUAN0 Between Groups (Combined) .000 11 .000 .274 .985
Linear Term Contrast .000 1 .000 .017 .897
Deviation .000 10 .000 .300 .974
Within Groups .000 24 .000
Total .000 35
TUAN2 Between Groups (Combined) .209 11 .019 9.313 .000
Linear Term Contrast .001 1 .001 .251 .621
Deviation .209 10 .021 10.219 .000
Within Groups .049 24 .002
Total .258 35
TUAN3 Between Groups (Combined) 1.373 11 .125 38.673 .000
Linear Term Contrast .086 1 .086 26.760 .000
Deviation 1.287 10 .129 39.864 .000
Within Groups .077 24 .003
Total 1.450 35
TUAN4 Between Groups (Combined) 3.268 11 .297 115.743 .000
Linear Term Contrast .020 1 .020 7.940 .010
Deviation 3.248 10 .325 126.523 .000
Within Groups .062 24 .003
Total 3.330 35
TUAN5 Between Groups (Combined) 3.790 11 .345 81.001 .000
Linear Term Contrast .079 1 .079 18.676 .000
Deviation 3.711 10 .371 87.234 .000
Within Groups .102 24 .004
Sum of
Squares df
Mean
Square F Sig.
TUAN0 Between Groups (Combined) .001 11 .000 .787 .650
Linear Term Contrast .000 1 .000 1.790 .193
Deviation .001 10 .000 .687 .726
Within Groups .002 24 .000
Total .003 35
TUAN2 Between Groups (Combined) .085 11 .008 2.500 .029
Linear Term Contrast .031 1 .031 9.987 .004
Deviation .054 10 .005 1.751 .126
Within Groups .074 24 .003
Total .160 35
TUAN3 Between Groups (Combined) .593 11 .054 16.406 .000
Linear Term Contrast .010 1 .010 3.081 .092
Deviation .583 10 .058 17.739 .000
Within Groups .079 24 .003
Total .672 35
TUAN4 Between Groups (Combined) 2.051 11 .186 55.189 .000
Linear Term Contrast .112 1 .112 33.132 .000 Deviation 1.939 10 .194 57.395 .000 Within Groups .081 24 .003 Total 2.132 35
TUAN5 Between Groups (Combined) 2.060 11 .187 44.024 .000
Linear Term Contrast .062 1 .062 14.607 .001 Deviation 1.998 10 .200 46.965 .000 Within Groups .102 24 .004 Total 2.162 35
Sum of
Squares df
Mean
Square F Sig.
TUAN0 Between Groups (Combined) .000 11 .000 .757 .677