4. Ý nghĩa thực tiễn
2.3.3 Thí nghiệm tạo chồi từ mô sẹo và tạo rễ từ những chồi thu nhận
Tạo chồi từ mô sẹo
Mô sẹo ñược chia làm 2 nhóm:
Nhóm 1: mô sẹo ñược hình thành trên môi trường MS chỉ bổ sung 2,4-D hoặc 2,4-D kết hợp với BA.
Nhóm 2: mô sẹo ñược hình thành trên môi trường MS bổ sung AIA kết hợp với BA. Chuyển mô sẹo tăng trưởng tốt từ kết quả của 2 nhóm trên vào môi trường MS bổ sung thêm chất ñiều hoà sinh trưởng cytokinin (BA) có hoặc không có kết hợp với AIA 0,02mg/l. Bảng 2.6 a: Bố trí thí nghiệm Nghiệm thức BA (mg/l) S0 0 S1 0,2 S2 0,5 S3 1 S4 1,5 S5 2 S6 2,5 S7 3
Bảng 2.6 b: Bố trí thí nghiệm Nghiệm thức BA (mg/l) AIA (mg/l) S8 0,2 0,02 S9 0,5 S10 1 S11 1,5 S12 2 S13 2,5 S14 3
Tạo rễ từ những chồi thu nhận
Các cụm chồi hình thành trên môi trường thích hợp ñược tách ra thành các chồi và tiến hành cấy chuyền vào môi trường MS cơ bản và MS bổ sung thêm AIA với nồng ñộ thay ñổi nhằm kích thích sự tạo rễ.
Bảng 2.7: Bố trí thí nghiệm Nghiêm thức AIA (mg/l) R0 0 R1 0,2 R2 0,5 R3 1 R4 1,5 - Nhiệt ñộ phòng nuôi: 220C ± 20C - Cường ñộ chiếu sáng 2000 ± 300lux - Thời gian chiếu sáng: 12 giờ/ngày - Ẩm ñộ trung bình 55% ± 10%.
• Quan sát thời ñiểm xuất hiện chồi ñầu tiên, tỷ lệ tạo chồi, số chồi ñược ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy.
• Quan sát thời ñiểm xuất hiện rễ ñầu tiên, tỷ lệ tạo rễ, số rễ, chiều dài rễ ñược ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy.
• Quan sát hình thái giải phẫu: mẫu ñược cắt bằng tay và quan sát dưới kính hiển vi quang học sự biến ñổi trong quá trình phát sinh hình thái chồi và rễ.
2.3.4 Khảo sát khả năng thích ứng của cây con ngoài vườn ươm
• Cây con in vitro có ñủ rễ ñược trồng trên giá thể trấu hun, tưới nước ngày 2 lần.
• Theo dõi tỷ lệ cây sống sót và sức sống của cây ngoài vườn ươm.
2.3.5 Đo cường ñộ hô hấp
Cường ñộ hô hấp của các mẫu thí nghiệm ñược xác ñịnh bằng máy ño sự trao ñổi khí Leafab 2 (Hansatech) với ñiện cực oxygen ở nhiệt ñộ 280C, ñơn vị tính là µmol/g trọng lượng tươi/giờ.
2.3.6 Xử lý số liệu
Khảo sát 10 mẫu/nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Các số liệu ñược xử lý thống kê bằng chương trình Statiscal Program Scienttific System (SPSS) phiên bản 16.0 dùng cho Windows. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,05 của giá trị ñược biểu hiện bằng các mẫu tự khác nhau.
3.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ các chất khử trùng và thời gian khử trùng lên hột mướp ñắng
(A)
(B) (C)
Hình 3.1 Tỷ lệ mẫu sạch và sống sau khi khử trùng bởi dung dịch chất khử trùng với nồng ñộ và thời gian khác nhau
(A): javel (B): calcium hypochlorite (C): thủy ngân chlorite Qua kết quả khử trùng ở hình 3.1 cho thấy:
Trong 3 chất khử trùng trên, dung dịch javel cho tỷ lệ mẫu sạch và sống thấp nhất (từ 66,67 – 86,67%) ñến dung dịch calcium hypochlorite (từ 66,67 - 90,00%). Dung dịch thủy ngân chlorite 0,1% cho tỷ lệ mẫu sạch và sống cao nhất (86,67 – 93,33%).
Nhìn chung, ñối với 2 chất khử trùng là dung dịch calcium hypochlorite và dung dịch javel, khi giảm nồng ñộ chất khử trùng, tỷ lệ mẫu sạch giảm ñáng kể.
Trong khi ñó, ở cùng nồng ñộ, tỷ lệ mẫu sạch không khác biệt nhiều khi xử lý với thời gian khác nhau. Do ñó, tỷ lệ mẫu sạch bị ảnh hưởng nhiều hơn bởi nồng ñộ chất khử trùng.
Như vậy, dung dịch thủy ngân chlorite 0,1%, thời gian xử lý 10 - 15 phút và dung dịch calcium hypochlorite 15% với thời gian khử trùng 20 phút thích hợp nhất ñể khử trùng hạt mướp ñắng.
3.2 Sự tạo mô sẹo
3. 2.1 Sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo từ các nguồn mẫu
Trong ñiều kiện tối hoàn toàn, ở hầu hết các nghiệm thức có bổ sung auxin (2,4-D, AIA) có hoặc không kết hợp cytokinin (BA), các nguồn mẫu (lá, lớp mỏng ñốt tử diệp, lớp mỏng tử diệp, lớp mỏng trụ hạ diệp) ñều hình thành mô sẹo sau một tuần nuôi cấy. Mô sẹo bắt ñầu xuất hiện tại những vết cắt ngang gân lá, phần ngoài rìa các nguồn mẫu. Sau ñó, kích thước, trọng lượng tươi của mô sẹo tăng dần theo thời gian nuôi cấy, ñặc biệt là khối mô sẹo tiếp xúc trực tiếp với môi trường. Ở các nghiệm thức không bổ sung chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật (L0, D0, T0, HD0, HN0) và các nghiệm thức chỉ bổ sung 2,4–D 1mg/l (L1, D1, T1, HD1, HN1) ñều có sự xuất hiện rễ (ảnh 3.1A, B; 3.3A, B; 3.5A, B; 3.7A, B).
3.2.1.1 Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lá
Bảng 3.1a: Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lá sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin (2,4-D)
Nghiệm thức Trọng lượng tươi (g)
2 tuần 3 tuần 4 tuần 5 tuần
L0 0,02± 0,00a 0,09 ± 0,01a 0,1 ± 0,01a 0,12 ± 0,01a L1 0,15 ± 0,04b 0,21 ± 0,07b 0,36 ± 0,02b 0,51 ± 0,02b L2 0,22 ± 0,05b 0,43 ± 0,03cd 0,61 ± 0,04c 0,67 ± 0,03c
L3 0,49 ± 0,01e 0,59 ± 0,02e 0,87 ± 0,01e 0,98 ± 0,29f
Ở các nghiệm thức chỉ bổ sung 2,4-D, mô sẹo ñược hình thành từ lá có màu vàng, trắng và xốp (ảnh 3.1B). Mô sẹo này bắt ñầu chuyển sang nâu và trở nên chắc hơn ở tuần thứ 4 và 5. Trọng lượng tươi khối mô sẹo tăng dần theo sự tăng của nồng ñộ 2,4-D. Trọng lượng tươi khối mô sẹo sau 5 tuần nuôi cấy khoảng 0,51 – 0,98g. Trong ñó, môi trường theo nghiệm thức bổ sung 2,4-D 1mg/l (L3) cho mô sẹo tốt nhất (0,98g) (bảng 3.1a).
Bảng 3.1b: Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lá sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) kết hợp với cytokinin (BA)
Nghiệm thức
Trọng lượng tươi (g)
2 tuần 3 tuần 4 tuần 5 tuần
L4 0,17 ± 0,03b 0,24 ± 0,04b 0,42 ± 0,02b 0,66 ± 0,02c L5 0,19 ± 0,02b 0,34 ± 0,02c 0,71 ± 0,02d 0,73 ± 0,02cd L6 0,22 ± 0,05b 0,45 ± 0,05d 0,65 ± 0,06cd 0,78 ± 0,06de L7 0,31 ± 0,03cd 0,53 ± 0,02de 0,85 ± 0,03e 1,03 ± 0,01f L8 0,39 ± 0,02de 0,71 ± 0,02f 1,02 ± 0,03f 1,03 ± 0,02f L9 0,59 ± 0,02f 0,87 ± 0,05g 1,04 ± 0,04f 1,30 ± 0,05g L10 0,19 ± 0,03b 0,35± 0,05c 0,68 ± 0,02cd 0,68 ± 0,03c L11 0,25 ± 0,05bc 0,47 ± 0,03d 0,71 ± 0,02d 0,82 ± 0,02e
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%
Đối với môi trường có bổ sung 2,4-D kết hợp với BA, mô sẹo có màu vàng hơi xanh, trắng, ít xốp hơn (ảnh 3.1C). Mô sẹo bắt ñầu chuyển sang nâu ở tuần thứ 5, chậm hơn so với những nghiệm thức chỉ có bổ sung 2,4-D (ảnh3.2).
Trọng lượng tươi khối mô sẹo tăng dần theo sự tăng của nồng ñộ 2,4–D và BA có trong môi trường nuôi cấy. Trọng lượng tươi khối mô sẹo sau 5 tuần nuôi cấy khoảng 0,66 – 1,30g (bảng 3.1b).
Đối với môi trường có bổ sung AIA kết hợp với BA 0,5mg/l (L10, L11), mô sẹo hình thành từ tuần 1 ñến tuần 4 có màu vàng xanh, trắng và xốp (ảnh 3.1D). Trọng lượng tươi khối mô sẹo tăng dần theo sự tăng của nồng ñộ AIA.
Sau 5 tuần nuôi cấy, trọng lượng tươi khối mô sẹo trong khoảng 0,68 – 0,82g, không có sự hình thành rễ ở các nghiệm thức (bảng3.1b, ảnh 3.1D).
Như vậy, nguồn auxin thích hợp cho sự hình thành mô sẹo từ lá mướp ñắng là 2,4-D, trong ñó môi trường theo nghiệm thức bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 1mg/l (L9) cho mô sẹo phát triển tốt nhất (1,30g).
Ảnh 3.1:Mô sẹo từ lá 3 tuần tuổi, mũi tên trắng chỉ rễ (A): môi trường MS ñối chứng
(B): môi trường MS bổ sung 2,4-D 1mg/l
(C): môi trường MS bổ sung 2,4-D 1mg/l Và BA 1mg/l
(D): môi trường MS bổ sung AIA 2mg/l và BA 0,5mg/l A B C D 1cm 1cm 1 cm 1 cm
Ảnh 3.2:Mô sẹo từ lá 5 tuần tuổi trên môi trường MS bổ sung 2,4-D1mg/l và BA 1mg/l
3.2.1.2 Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp
Bảng 3.2a: Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng ñốt tử diệp sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin (2,4-D)
Nghiệm thức Trọng lượng tươi (g)
2 tuần 3 tuần 4 tuần 5 tuần
D0 0,02 ± 0,00a 0,03 ± 0,00a 0,11 ± 0,01a 0,19 ± 0,03a D1 0,12 ± 0,04b 0,23 ± 0,02b 0,46 ± 0,02b 0,53 ± 0,02b D2 0,12 ± 0,01b 0,27 ± 0,03b 0,53 ± 0,04b 0,66 ± 0,05c
D3 0,25 ± 0,04c 0,64 ± 0,02de 0,86 ± 0,02e 0,94 ± 0,03ef
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%
Các nghiệm thức chỉ bổ sung 2,4-D, sau 3 tuần nuôi cấy, mô sẹo ñược hình thành có màu vàng ñậm, trắng và xốp (ảnh 3.3B). Mô sẹo này bắt ñầu chuyển sang nâu và trở nên chắc hơn ở tuần thứ 4. Trọng lượng tươi khối mô sẹo tăng dần theo sự tăng của nồng ñộ 2,4-D. Trọng lượng tươi khối mô sẹo sau 5 tuần nuôi cấy khoảng 0,53 – 0,94g. Trong ñó, môi trường theo nghiệm thức bổ sung 2,4-D 1mg/l (D3) cho mô sẹo tốt nhất (0,94g) (bảng 3.2a).
Bảng 3.2b: Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng ñốt tử diệp sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) kết hợp với
cytokinin (BA)
Nghiệm thức
Trọng lượng tươi (g)
2 tuần 3 tuần 4 tuần 5 tuần
D4 0,15 ± 0,01b 0,24 ± 0,04b 0,47 ± 0,02b 0,54 ± 0,03b D5 0,15 ± 0,02b 0,28 ± 0,03b 0,67 ± 0,02c 0,86 ± 0,02de D6 0,19 ± 0,05bc 0,24 ± 0,04b 0,73 ± 0,06cd 0,86 ± 0,04de D7 0,15 ± 0,01b 0,47 ± 0,05c 1,04 ± 0,03f 1,03 ± 0,03f D8 0,20 ± 0,04bc 0,59 ± 0,05d 1,08 ± 0,03f 1,17 ± 0,04g D9 0,33 ± 0,01d 0,73 ± 0,01e 1,23 ± 0,04g 1,53 ± 0,04h D10 0,19 ± 0,01bc 0,38 ± 0,02c 0,77 ± 0,02d 0,81 ± 0,05d D11 0,24 ± 0,01c 0,40 ± 0,03c 0,86 ± 0,02e 0,89 ± 0,05de
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%
Đối với môi trường có bổ sung 2,4-D kết hợp với BA, mô sẹo có màu vàng xanh, trắng, ít xốp hơn ( ảnh 3.3D). Mô sẹo bắt ñầu chuyển sang nâu ở tuần thứ 5, chậm hơn so với những nghiệm thức chỉ có bổ sung 2,4-D (ảnh3.4).
Trọng lượng tươi khối mô sẹo tăng dần theo sự tăng của nồng ñộ 2,4–D và BA có trong môi trường nuôi cấy. Trọng lượng tươi khối mô sẹo sau 5 tuần nuôi cấy khoảng 0,54 – 1,53g (bảng 3.2b).
Đối với môi trường có bổ sung AIA kết hợp với BA 0,5mg/l (D10, D11), mô sẹo hình thành từ tuần 1 ñến tuần 4 có màu vàng xanh, trắng và xốp. Trọng lượng tươi khối mô sẹo tăng dần theo sự tăng của nồng ñộ AIA. Trọng lượng tươi khối mô sẹo sau 5 tuần nuôi cấy trong khoảng 0,81 – 0,89g, không có sự hình thành rễ ở các nghiệm thức (bảng3.2b, ảnh 3.3D).
Sự hình thành mô sẹo không ñồng ñều ở các lớp mỏng ñốt tử diệp. Lớp mỏng ñốt tử diệp ở giữa ñốt, mô sẹo ñược hình thành nhiều nhất, ñến ñầu ñốt, sau cùng là cuối ñốt tử diệp (tính theo chiều từ trên chồi ngọn xuống rễ của cây).
Như vậy, sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo cũng giống như các mẫu lá tương ứng trên các môi trường chỉ bổ sung 2,4–D hoặc môi trường có bổ sung 2,4–D kết hợp với BA hay môi trường có bổ sung AIA kết hợp với BA. Nguồn auxin thích hợp
cho sự hình thành mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp là 2,4-D. Môi trường theo nghiệm thức có nồng ñộ 2,4–D 1mg/l và BA 1mg/l (D3), sự hình thành mô sẹo tốt nhất (1,53g) (bảng 3.2a, b; ảnh 3.3).
Ảnh 3.3:Mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp 3 tuần tuổi, mũi tên chỉ rễ (A): môi trường MS ñối chứng
(B): môi trường MS bổ sung 2,4-D 1mg/l
(C): môi trường MS bổ sung 2,4-D 1mg/l Và BA 1mg/l
(D): môi trường MS bổ sung AIA 2mg/l và BA 0,5mg/l 1 cm A B 1.2 cm C 1 cm D 1 cm
Ảnh 3.4:Mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp 5 tuần tuổi trên môi trường MS bổ sung 2,4- D1mg/l và BA 1mg/l
3.2.1.3 Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng tử diệp
Bảng 3.3a: Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng tử diệp sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin (2,4-D)
Nghiệm thức
Trọng lượng tươi (g)
2 tuần 3 tuần 4 tuần 5 tuần
T0 0,12 ± 0,03ab 0,13 ± 0,02a 0,13 ± 0,05a 0,14 ± 0,0289a T1 0,11 ± 0,01ab 0,24 ± 0,02b 0,33 ± 0,02b 0,41 ± 0,0150b T2 0,19 ± 0,04abc 0,27 ± 0,03bc 0,49 ± 0,05cde 0,45 ± 0,0502b
T3 0,18 ± 0,04abc 0,48 ± 0,02f 0,77 ± 0,04f 0,83 ± 0,0318e
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%
Đối với môi trường chỉ bổ sung 2,4-D, sau 3 tuần nuôi cấy, mô sẹo ñược hình thành từ lớp mỏng tử diệp có màu vàng hơi xanh, trắng và xốp (ảnh 3.3B). Mô sẹo này bắt ñầu chuyển sang nâu và trở nên chắc hơn ở tuần thứ 4. Trọng lượng tươi khối mô sẹo tăng dần theo sự tăng của nồng ñộ 2,4-D. Trọng lượng tươi khối mô sẹo sau 5 tuần nuôi cấy khoảng 0,41 – 0,83g. Trong ñó, môi trường theo nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l (T3) cho mô sẹo tốt nhất (0,83g) (bảng 3.3a).
Bảng 3.3b: Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng tử diệp sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) kết hợp với cytokinin (BA)
Nghiệm thức
Trọng lượng tươi (g)
2 tuần 3 tuần 4 tuần 5 tuần
T4 0,12 ± 0,01ab 0,26 ± 0,04bc 0,41 ± 0,02bc 0,42 ± 0,03b T5 0,13 ± 0,01ab 0,36 ± 0,03de 0,44 ± 0,02cd 0,57 ± 0,02cd T6 0,12 ± 0,05ab 0,38 ± 0,04de 0,47 ± 0,05cde 0,52 ± 0,04bc T7 0,25 ± 0,02c 0,51 ± 0,05f 0,95 ± 0,04g 0,99 ± 0,03f T8 0,22 ± 0,01bc 0,54 ± 0,05f 0,94 ± 0,02g 0,92 ± 0,04ef T9 0,21 ± 0,03abc 0,55 ± 0,01f 0,81 ± 0,02f 0,85 ± 0,04e T10 0,10 ± 0,05a 0,35 ± 0,04cd 0,54 ± 0,01de 0,60 ± 0,05cd T11 0,11 ± 0,04ab 0,46 ± 0,03ef 0,57 ± 0,02e 0,64 ± 0,05d
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%
Sự thay ñổi màu sắc, ñặc ñiểm mô sẹo cũng giống như mô sẹo ñược hình thành từ lớp mỏng ñốt tử diệp tương ứng trên các môi trường bổ sung 2,4-D kết hợp với BA hay AIA kết hợp với BA (ảnh 3.5, 3.6).
Ở các nghiệm thức có bổ sung 2,4-D kết hợp với BA, trọng lượng tươi khối mô sẹo tăng dần theo sự tăng của nồng ñộ 2,4–D và BA có trong môi trường nuôi cấy. Trọng lượng tươi khối mô sẹo sau 5 tuần nuôi cấy khoảng 0,57 – 0,99g (bảng 3.3b).
Đối với môi trường có bổ sung AIA kết hợp với BA 0,5mg/l (T10, T11), trọng lượng tươi khối mô sẹo tăng dần theo sự tăng của nồng ñộ AIA. Trọng lượng tươi khối mô sẹo sau 5 tuần nuôi cấy trong khoảng 0,60 – 0,64g, không có sự hình thành rễ ở các nghiệm thức (bảng3.3b, ảnh 3.5D).
Sự hình thành mô sẹo không ñồng ñều ở các lớp mỏng. Lớp mỏng ñầu tử diệp, mô sẹo ñược hình thành nhiều nhất, sau ñó giảm dần ñến lát mỏng cuối tử diệp (tính từ gốc ñến chóp tử diệp).
Như vậy, nguồn auxin thích hợp cho sự hình thành mô sẹo từ lớp mỏng tử diệp là 2,4-D. Môi trường có nồng ñộ 2,4–D 1mg/l và BA 0,2mg/l (T7), sự hình thành mô sẹo tốt nhất (0,99g) (bảng 3.3a,b; ảnh 5.5).
Ảnh 3.5:Mô sẹo từ lớp mỏng tử diệp 3 tuần tuổi, mũi tên trắng chỉ rễ (A): môi trường MS ñối chứng
(B): môi trường MS bổ sung 2,4-D 1mg/l
(C): môi trường MS bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 1mg/l
(D): môi trường MS bổ sung AIA 2mg/l và BA 0,5mg/l
A 1cm B 1cm
1cm 1cm
D
Ảnh 3.6:Mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp 5 tuần tuổi trên môi trường MS bổ sung AIA 2mg/l