4. Ý nghĩa thực tiễn
1.1.2 Đặc tính sinh học
1.1.2.1 Mô tả hình thái
Mướp ñắng là loại cây dây leo có tua cuốn, thân có góc cạnh, ở ngọn hơi có lông tơ. Lá mọc so le, dài 5 - 10cm, rộng 4 - 8cm, phiến lá chia 5 - 7 thùy hình tim tròn, mép có răng cưa ñều, mặt dưới lá mầu nhạt hơn mặt trên, trên gân lá có lông ngắn. Hoa mọc ñơn ñộc ở kẽ lá, ñực cái cùng gốc, có cuống dài, cánh hoa màu vàng nhạt, ñường kính của hoa chừng 2cm.
Trái hình thoi dài 8 - 15cm, trên mặt có nhiều u nổi lên, trái chưa chín có màu xanh hoặc vàng xanh, khi chín có màu vàng hồng, trong trái có hột dẹt dài 13 - 15mm, rộng 7 - 8mm, gần giống hột bí ngô, quanh hột có màng màu ñỏ như màng gấc [28].
1.1.2.2 Điều kiện sống và phân bố
Mướp ñắng dễ trồng, không kén ñất. Là cây ưa ẩm, ưa sáng, sợ úng. Vì trái mướp ñắng có hình dạng ngộ nghĩnh, ñẹp nên còn ñược trồng làm cảnh, lấy bóng mát kết hợp ăn trái, làm thuốc trong gia ñình.
Trên thế giới, mướp ñắng ñược trồng nhiều ở các nước châu Á, Mỹ Latinh. Ở nước ta, mướp ñắng ñược trồng ở khắp mọi miền. Mùa quả ở miền Bắc là các tháng 5-6-7. Riêng ở các tỉnh miền Nam, mướp ñắng có quanh năm [28].
1.1.2.3 Sâu bệnh
Sâu hại chính thường có.
- Giòi ñục trái (Zeugodacus caudatus): phải chú ý phòng trừ sớm khi ruồi mới ñẻ trứng, thường vào giai ñoạn quả mới ñậu hoặc còn non.
- Sâu xanh (Hilecoverpa armigera): sâu hại hoa và trái ở tất cả các thời kỳ. - Giòi ñục lá (Liriomyza spp.) làm trắng lá, ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng của cây.
- Khi mật ñộ các loài sâu hại cao có thể sử dụng các biện pháp sau :
+ Thuốc trừ sâu sinh học: các lọai BT, Aztrol, Dipel, Xenteri,... thời gian cách ly 3 ngày khi cây có hoa và trái non.
+ Thuốc trừ sâu hóa học: Sherpa 25 EC, Match 50 ND, Success 25 SC, Vertimec 1.8 EC,… theo hướng dẫn ghi trên bao bì, thời gian cách ly từ 7 -10 ngày.
+ Sau thời kỳ ra hoa và ñậu trái non chỉ ñược dùng thuốc sinh học, chủ yếu các loại thuốc BT.
- Bệnh hại: bệnh phấn trắng (Erysiphe sp.) hại chủ yếu trên lá, cần phòng trừ sớm bằng các thuốc: Ridomin MZ 72WP nồng ñộ từ 30-50g/10lít nước. Thời gian cách ly 7-10ngày; Validacin 3SL nồng ñộ 0.1-0.2%. Thời gian cách ly tối thiểu 10 ngày. Khi sử dụng thuốc ñều phải tuân theo hướng dẫn trên nhãn bao bì của từng loại thuốc [28].
1.1.3 Thành phần và tác dụng các hợp chất tự nhiên của cây mướp ñắng
Năm 1990, Liên Hiệp Quốc phát hành bộ tem dược thảo, mỗi con tem là một cây thuốc ñược Liên Hiệp Quốc cho là có giá trị chữa bệnh trên thế giới, mướp ñắng ñược chọn làm một trong 6 cây tiêu biểu [23].
Mướp ñắng có thành phần dinh dưỡng cao. Trong 100g trái mướp ñắng chứa: chất béo 0,10g; chất ñạm 0,90g; chất bột ñường 4,70g; các khoáng chất như K 250mg, Ca 22mg, Mg 16mg, Fe 0,9mg, Zn 0,1g. Các vitamin: A 4mg, C 50g, B1 0,05mg, B2 0,03mg, PP 0,40mg…
Trong lá và trái mướp ñắng có chứa polyphenol và flavonoid (mùa ñông cao hơn mùa hè một chút), hàm lượng polyphenol và flavonoid trong trái cao hơn trong lá: polyphenol: 3,85% trong trái; 3,09% trong lá già. flavonoid: 1,34% trong trái; 1,12% trong lá già. Các chất quan trọng là glycosid: charantin và momordicin. Charantin và polypeptid – P có tác dụng làm hạ ñường huyết. Momordicin có tác dụng diệt vi khuẩn, siêu vi và hỗ trợ cho cơ thể chống lại các tế bào ung thư ñang phát triển, alkaloid trong mướp ñắng có công hiệu lợi tiểu, máu lưu thông, chống viêm, hạ sốt, mát gan, sáng mắt, phòng chống ung thư... [24].
Năm 1984, nhiều nhà sinh hóa và dược lý của các nước vùng Caribê ñã công bố: chất momordicosid trong trái mướp ñắng là một hợp chất có tác dụng sinh học quan trọng làm giảm glucose trong máu… Đặc biệt, polypeptid-P (P- insulin; plantinsulin) ñược cô lập từ trái, hột và các mô trong thân, lá… có tác dụng sinh học gần giống insulin, giúp cơ thể tăng tiết insulin, làm hạ glucose trong máu có tác dụng cải thiện rõ sự dung nạp glucose ở người tiểu ñường týp II trong giai ñoạn chưa có biến chứng ñã ñược công bố ở nhiều nước trên thế giới [25].
Theo Nguyễn Minh Đức và cộng sự (2002), từ hột mướp ñắng ñã chiết xuất và phân lập ñược 4 hợp chất Mc1, Mc2, Mc3, Mc4. Trong ñó Mc1 ñược xác ñịnh là
momordicosid A có tác dụng sinh học (diệt khuẩn) dựa vào mô hình thử tác dụng ñộc trên ấu trùng tôm biển (Artemia salina) [1].
1.2. Sự tạo mô sẹo và phát sinh hình thái 1.2.1 Sự tạo mô sẹo 1.2.1 Sự tạo mô sẹo
Trong nuôi cấy in vitro, mô sẹo là ñám tế bào không phân hoá, có ñặc tính phân chia mạnh, thường ñược tạo ra từ những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan. Do ñó, các phần non của cơ thể thực vật (mô phân sinh ngọn, thân, rễ…) dễ cho mô sẹo trong ñiều kiện nuôi cấy in vitro, dưới tác ñộng của một auxin mạnh ñược áp dụng riêng rẽ hay kết hợp với cytokinin. Ngược lại, những mảnh cơ quan trưởng thành thường không có khả năng tạo mới cơ quan, cũng không có khả năng tạo mô sẹo [10],[11].
Sự tạo mô sẹo, nhờ auxin, thuộc một trong ba quá trình:
- Sự phản phân hoá của các tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong cơ quan).
- Sự phân chia của các tế bào tượng tầng.
- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ). Trong quá trình này ñược ưu tiên áp dụng ở cây một lá mầm, vì các cây này không có các tượng tầng ñiển hình, và các tế bào nhu mô khó phản phân hoá (so với cây hai lá mầm).
Để tạo mô sẹo, cần chú ý ñến tình trạng sinh lý của mô cấy, sự dùng auxin riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin, bản chất và nồng ñộ auxin [11].
1.2.2 Sự phát sinh hình thái
Phát sinh hình thái là sự phát triển của cơ thể thực vật: tế bào, mô, cơ quan theo thời gian, từ lúc khởi ñầu cho ñến lúc trưởng thành, ñể hoàn tất chu trình phát triển. Bao gồm quá trình:
- Phát sinh mô (histogenesis)
- Phát sinh cơ quan (organogenesis) - Phát sinh phôi (embryogenesis)
Trong chu trình phát triển, mỗi thực vật ñều ở trạng thái cử ñộng phát sinh hình thái. Các cơ quan thực vật tác ñộng lẫn nhau trong sự phát triển của riêng mình, sự tiến hoá của những cơ quan phụ thuộc vào sự tiến hoá của những cơ quan khác, cấu trúc toàn vẹn của cơ thể thực vật là do toàn bộ các tương tác giữa các cấu trúc hợp thành.
Ở môi trường nhân tạo, mô cấy thoát khỏi sự tương quan mà nó phải chịu trong cơ thể thực vật nguyên vẹn ñể thiết lập một tương quan mới. Tuy nhiên, dù trong các ñiều kiện in vitro, sự phát triển của thực vật là một chuỗi lần lượt các quá trình liên tiếp nhau theo một trật tự không thể ñảo ngược.
• Sự phát sinh cơ quan
Phát sinh cơ quan là quá trình các tế bào và mô tạo ra cấu trúc một cực, cực chồi hoặc cực rễ. Đây là một quá trình liên quan ñến sự tăng sinh và sự phân hóa tế bào, phụ thuộc vào thành phần và hàm lượng của các chất ñiều hoà tăng trưởng thực vật khác nhau [11], [29].
Trong thiên nhiên, sự phát sinh cơ quan có nguồn gốc từ các mô phân sinh ngọn. Mô phân sinh ngọn chồi ở cây hạt kín thường có ñường kính 100 - 200µm, với các tế bào ñang phân chia, chưa biệt hoá cao về mặt hình thái, nhưng có khả năng phát sinh hình thái.
Mô phân sinh ngọn có vai trò quan trọng trong sự hình thành cơ quan và duy trì chính nó. Việc duy trì tính toàn vẹn của mô phân sinh ngọn ñòi hỏi sự chính xác trong phân chia, tăng rộng và biệt hoá của tế bào. Các tế bào ở vùng vỏ phân chia theo hướng thẳng góc với bề mặt mô phân sinh cho ra các lớp biểu bì và dưới biểu bì của thân và lá. Một số ít tế bào từ phân chia trong vỏ và có thể cho sự khởi lá, thân, nụ nách và các bộ phận của hoa (nếu là nụ hoa). Các tế bào của vùng thể phân chia vừa theo hướng thẳng góc vừa theo hướng song song với bề mặt của mô phân sinh làm gia tăng thể tích tế bào [11],[29].
Trong nuôi cấy in vitro, sự phát sinh cơ quan (chồi hay rễ) có thể ñược thực hiện từ chồi hiện diện sẵn hay từ sự tạo mới.
- Sự phát triển chồi
Các chồi tận cùng và các chồi nách hiện diện sẵn, ở trạng thái hoạt ñộng hay nghỉ, có thể phát triển in vitro (không phải sự tạo mới cơ quan). Một mô cấy chứa một chồi duy nhất có thể phát triển thành một chồi duy nhất hay cụm chồi, tùy thuộc vào loài, trạng thái sinh lý của mô cấy và môi trường nuôi cấy.
Kích thích sự phát triển của chồi hiện diện sẵn là phương pháp vi nhân giống chậm nhất, nhưng là cách thông dụng, dễ áp dụng nhất trong hầu hết các loài thực vật, ñặc biệt ñối với các cây gỗ (vì sự sinh phôi thế hệ và tăng trưởng chồi/rễ bất ñịnh khó thực hiện hơn).
- Sự tạo mới chồi
Mọi cơ quan thực vật ñều có khả năng tái sinh các mô phân sinh ngọn chồi bởi sự sinh cơ quan trực tiếp hay gián tiếp. Ở cây hột kín, nguồn gốc của mô phân sinh ngọn chồi có thể là tế bào biểu bì, mô hàng rào (mô dậu), mô khuyết hay mô bao quanh mạch của mẫu cấy.
Trước sự phân hoá ñể tạo tầng phát sinh của chồi ñược tạo mới, tiền mô phân sinh hay tế bào phân hoá ñều phải qua sự tái hoạt ñộng. Sự tái hoạt ñộng này có thể ñược cảm ứng trên cây nguyên bằng sự ñàn áp các hiệu ứng cản tương
quan (thí dụ: cắt bỏ vùng ngọn ñể gỡ ưu tính ngọn) hay trên mô cấy nhờ các môi trường thích hợp. Sự tái hoạt ñộng gồm hai giai ñoạn: khử phân hoá và tái phân hóa.
Trong sự tạo mới chồi từ các tế bào lá ñã phân hóa, người ta cho rằng có sự hiện diện của các nhóm tế bào ñặc biệt, gọi là mô ñích. Các tế bào này là nơi nhận các thông tin hoá học, ñặc biệt là chất ñiều hòa tăng trưởng thực vật: nếu auxin có tác dụng tạo rễ ñối với các mô quanh mạch (nguồn gốc nội sinh của rễ) thì citokinin có tác dụng tạo chồi ñối với các mô ngoại vi (nguồn gốc ngoại sinh của chồi). Tỷ lệ auxin/cytokinin xác ñịnh một chương trình phát sinh hình thái (rễ hay chồi) [8].
- Sự phát sinh rễ
Sự thành lập rễ bao gồm 2 giai ñoạn có thể thấy ñược dưới kính hiển vi: giai ñoạn tạo sơ khởi rễ từ vài tế bào của tầng phát sinh libe - mộc hay chu luân và giai ñoạn kéo dài sơ khởi rễ này.
Trong phần lớn trường hợp, sự hiện diện của cytokinin giúp cho sự tạo chồi sẽ cản sự tạo rễ. Do ñó môi trường cảm ứng sự tạo rễ phải là môi trường khác và ñôi khi phải qua nhiều lần cấy chuyền trên môi trường không có cytokinin.
Một ñiều cần ñược lưu ý trong sự tái sinh cây từ mô sẹo là nguy cơ biến dị thể hệ. Những biến ñổi về di truyền sẽ xảy ra khi cây ñược tái sinh từ mô sẹo ñược cấy chuyền qua nhiều lần và duy trì trong thời gian dài [15].
1.2.3 Vai trò của các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật 1.2.3.1 Auxin 1.2.3.1 Auxin
Auxin rất cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào nên nó có vai trò quan trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật. Auxin ñược tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá non ( là các nơi có sự phân chia tế bào nhanh). Sau ñó, auxin di chuyển hướng gốc tới rễ và tích tụ trong rễ [11].
Auxin ở nồng ñộ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ nhưng cản sự tăng trưởng của các sơ khởi rễ này [7]. Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các vitamin (như thiamin mà rễ không tổng hợp ñược), acid amin (như arginin), và nhất là các hợp chất ortho-diphenolic (như acid cafeic, acid chlorogenic) [11].
Auxin cảm ứng hoạt ñộng của mô phân sinh rễ, chất này di chuyển từ gốc ñến ngọn rễ và ñẩy mạnh sự phân chia tế bào tại ñây. Điều này cho thấy tác ñộng của auxin chủ yếu trong giai ñoạn phân chia tế bào chứ không phải suốt quá trình kéo dài rễ [15].
Trong số các loại auxin ñược sử dụng trong nuôi cấy in vitro, 2,4-D ñược xem là một auxin mạnh, có tác ñộng hình thành mô sẹo. Tuy nhiên nếu sử dụng nồng ñộ quá cao, auxin này sẽ gây ñộc cho tế bào, thậm chí gây biến ñổi di truyền. Trong sự hình thành sơ khởi rễ bất ñịnh, sử dụng NAA, AIA hay IBA thường ñược hiệu quả cao hơn so với 2,4-D. Tuy nhiên, tác ñộng của auxin ngoại sinh trong sự phát sinh hình thái cơ quan còn tùy thuộc vào trạng thái sinh lý cũng như hàm lượng chất ñiều hòa sinh trưởng nội sinh trong mô cấy. Trong suốt quá trình tạo rễ bất ñịnh, hàm lượng AIA tích lũy tăng cao. Điều này ñược giải thích là do auxin ngoại sinh ức chế hoạt ñộng của enzyme IAA oxidase và IBA có khả năng chuyển ñổi thành AIA. Do ñó cũng làm tăng nhanh lượng IAA nội sinh, kích thích sự hình thành rễ bất ñịnh [15].
1.2.3.2 Cytokinin
Trong thực vật, cytokinin ñược tổng hợp chủ yếu từ mô phân sinh ngọn rễ. Từ ñó chúng ñược vận chuyển trong mạch mộc tới chồi. Tuy nhiên, các chồi và phôi cũng là nơi tổng hợp cytokinin [11].
Ở rễ, cytokinin cản sự kéo dài nhưng kích thích tăng rộng tế bào [7]. Cytokinin ngăn cản sự lão hóa, thúc ñẩy sự trưởng thành của diệp lạp và là nhân tố chính ñiều khiển quá trình tái sinh mạch giúp cho sự tạo chồi [4]. Trong sự hình thành chồi,
cytokinin có thể ñược sử lý riêng rẻ hay phối hợp ñể làm tăng khả năng hình thành và chất lượng của chồi.
Ở nồng ñộ cytokinin cao giúp tạo thành cụm chồi. Số lượng chồi hình thành tùy thuộc vào nồng ñộ cytokinin. Cytokinin ở nồng ñộ thấp kích thích chồi nách phát triển. Nồng ñộ cao hơn sẽ cảm ứng hình thành chồi bất ñịnh nhưng chồi rất khó ra rễ.
Ở một số loài thực vật, mặc dù sự hình thành chồi ñược cảm ứng bởi cytokinin nhưng chồi không xuất hiện cho ñến khi mẫu ñược chuyển sang môi trường giảm hoặc không có cytokinin. Cytokinin cần cho giai ñoạn cảm ứng tạo chồi nhưng kìm hãm sự kéo dài của chồi. Những vấn ñề này có thể khắc phục bằng cách giảm nồng ñộ chất ñiều hòa sau vài lần cấy chuyền ñể chồi ñược phát triển tốt [15].
1.2.3.3 Sự phối hợp auxin và cytokinin trong phát sinh cơ quan
Auxin phối hợp với cytokinin giúp tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Tuy nhiên, ở nồng ñộ cao, auxin cản sự phát triển của phát thể chồi vừa thành lập hay của chồi nách [11].
Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, nhất là khi phối hợp với auxin. Cytokinin tác ñộng trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào. Dù hỗ trợ auxin trong sự tăng trưởng nhưng cũng có sự ñối kháng giữa cytokinin (giúp sự tạo chồi) auxin (giúp sự tạo rễ). Vì vậy, trong con ñường phát sinh hình thái thông qua mô sẹo, việc phối hợp cytokinin và auxin sẽ quyết ñịnh chiều hướng phát sinh hình thái. Miller và Skoog (1965) ñã chứng minh mô sẹo thuốc lá tạo rễ hay chồi tuỳ theo tỷ lệ auxin/cytokinin thấp giúp sự tạo chồi [11].
1.2.2.4 Giberelin
Giberelin kích thích sự kéo dài tế bào bởi cơ chế kiểm soát hướng ñặt của các vi sợi. Nó cũng có tác dụng kéo dài lóng do sự phối hợp hoạt tính kéo dài và phân chia tế bào thân. Giberelin kích thích mạnh sự phân chia tế bào nhu mô vỏ và biểu bì. Giberelin cũng có tác ñộng kích thích sự tăng trưởng chồi và gỡ sự ngủ của chồi.
Tuy nhiên giberelin có những ảnh hưởng khác nhau trên sự hình thành chồi trong nuôi cấy in vitro ở những loại thực vật khác nhau [11].