4. Ý nghĩa thực tiễn
3.2.3 Sự thay ñổi cường ñộ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo ñược hình
hình thành từ các nguồn mẫu
Khi xác ñịnh CĐHH bằng máy ño sự trao ñổi khí Hansatech, kết quả cho thấy, các nghiệm thức chỉ bổ sung 2,4-D có CĐHH cao nhất chủ yếu ở tuần thứ 2, bắt ñầu giảm ở tuần thứ 3, 4. Còn các nghiệm thức có bổ sung 2,4-D kết hợp với BA, thường CĐHH cao ở tuần thứ 2, tăng mạnh ở tuần thứ 3, sau ñó giảm dần ở tuần thứ 4 và thứ 5. CĐHH giảm dần theo sự giảm của nồng ñộ 2,4–D và BA trong môi trường nuôi cấy (hình 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6).
C B
3.2.3.1 Sự thay ñổi cường ñộ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo ñược hình thành từ lá hình thành từ lá hình thành từ lá hình thành từ lá
(A) (B)
Hình 3.2: Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lá theo thời gian.
(A) : môi trường chỉ bổ sung 2,4-D ở các nồng ñộ khác nhau
(B) : môi trường bổ sung 2,4-D kết hợp với BA ở các nồng ñộ khác nhau
Đối với nguồn mẫu là lá, khi xử lý 2,4-D ở các nồng ñộ khác nhau, kết quả cho thấy, CĐHH ở các nghiệm thức cao nhất ở tuần thứ 2, bắt ñầu giảm ở tuần thứ 3, 4. Trong ñó, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l (L3) có CĐHH cao nhất (7,92µmol/g/giờ) (hình 3.2A).
Khi sử lý phối hợp 2,4-D với BA ở các nồng ñộ khác nhau, CĐHH ở các nghiệm thức cao ở tuần thứ 2, tăng mạnh ở tuần thứ 3, sau ñó giảm dần ở tuần thứ 4 và thứ 5. Trong ñó, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l phối hợp với BA 1mg/l (L9) có CĐHH cao nhất (9,66µmol/g/giờ) (hình 3.2B).
CĐHH giảm dần theo sự giảm của nồng ñộ 2,4–D và BA trong môi trường nuôi cấy.
Vậy, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l kết hợp với BA 1mg/l (L9) có CĐHH cao nhất (9,66µmol/g/giờ).
3.2.3.2 Sự thay ñổi cường ñộ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo ñược hình thành từ lớp mỏng ñốt tử diệp
(A) (B)
Hình 3.3: Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng ñốt tử diệp theo thời gian.
(A) : môi trường chỉ bổ sung 2,4-D ở các nồng ñộ khác nhau (B): môi trường bổ sung 2,4-D kết hợp với BA ở các nồng ñộ khác nhau
Đối với nguồn mẫu là lớp mỏng ñốt tử diệp, khi xử lý 2,4-D ở các nồng ñộ khác nhau, kết quả cũng cho thấy, CĐHH ở các nghiệm thức cao nhất ở tuần thứ 2, bắt ñầu giảm ở tuần thứ 3, 4. Trong ñó, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l (D3) có CĐHH cao nhất (8,76µmol/g/giờ) (hình 3.3A).
Khi sử lý phối hợp 2,4-D với BA ở các nồng ñộ khác nhau, CĐHH ở các nghiệm thức cao ở tuần thứ 2, tăng mạnh ở tuần thứ 3, sau ñó giảm dần ở tuần thứ 4 và thứ 5. Trong ñó, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l phối hợp với BA 1mg/l (D9) có CĐHH cao nhất (11,77µmol/g/giờ) (hình 3.3B).
CĐHH giảm dần theo sự giảm của nồng ñộ 2,4–D và BA trong môi trường nuôi cấy.
Như vậy, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l kết hợp với BA 1mg/l (D9) có CĐHH cao nhất (11,77 µmol/g/giờ).
3.2.3.3 Sự thay ñổi cường ñộ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo ñược hình thành từ lớp mỏng tử diệp
(A) (B)
Hình 3.4: Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng tử diệp theo thời gian. (A): môi trường chỉ bổ sung 2,4-D ở các nồng ñộ khác nhau (B): môi trường bổ sung 2,4-D
kết hợp với BA ở các nồng ñộ khác nhau
Tương tự như lá và lớp mỏng ñốt tử diệp, khi xử lý 2,4-D ở các nồng ñộ khác nhau, kết quả cho thấy, CĐHH ở các nghiệm thức cao nhất ở tuần thứ 2, bắt ñầu giảm ở tuần thứ 3, 4. Trong ñó, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l (T3) có CĐHH cao nhất (6,00µmol/g/giờ) (hình 3.4A).
Khi sử lý phối hợp 2,4-D với BA ở các nồng ñộ khác nhau, CĐHH ở các nghiệm thức cao ở tuần thứ 2, tăng mạnh ở tuần thứ 3, sau ñó giảm dần ở tuần thứ 4 và thứ 5. Trong ñó, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l phối hợp với BA 0,2mg/l (T7) có CĐHH cao nhất (6,10µmol/g/giờ) (hình 3.4B).
CĐHH giảm dần theo sự giảm của nồng ñộ 2,4–D và BA trong môi trường nuôi cấy. Vậy, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l kết hợp với BA 0,5mg/l (T8) có CĐHH cao nhất (11,77 µmol/g/giờ).
3.2.3.4 Sự thay ñổi cường ñộ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo ñược hình thành từ lớp mỏng trụ hạ diệp
(A) (B)
Hình 3.5: Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc diệp theo thời gian.
(A): môi trường chỉ bổ sung 2,4-D ở các nồng ñộ khác nhau, (B): môi trường bổ sung 2,4-D kết hợp với BA ở các nồng ñộ khác nhau
Đối với lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc, sự thay ñổi cường ñộ hô hấp theo thời gian khi xử lý 2,4-D hay xử lý phối hợp 2,4-D với BA ở các nồng ñộ khác nhau tương tự như lớp mỏng tử diệp nhưng các nghiệm thức có CĐHH thấp hơn (hình 3.5).
Trong các nghiệm thức chỉ bổ sung 2,4-D, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l (HD3) có CĐHH cao nhất (2,34µmol/g/giờ) (hình 3.5A).
Ở các nghiệm thức có bổ sung phối hợp 2,4-D với BA, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l phối hợp với BA 0,5mg/l (HD8) có CĐHH cao nhất (3,50µmol/g/giờ) (hình 3.5B).
CĐHH giảm dần theo sự giảm của nồng ñộ 2,4–D và BA trong môi trường nuôi cấy. Trong ñó, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l kết hợp với BA 0,5mg/l (HD8) có CĐHH cao nhất.
(A) (B)
Hình 3.6: Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt ngang theo thời gian.
(A) : môi trường chỉ bổ sung 2,4-D ở các nồng ñộ khác nhau, (B): môi trường bổ sung 2,4- D kết hợp với BA ở các nồng ñộ khác nhau
Đối với lớp mỏng trụ hạ diệp cắt ngang, sự thay ñổi cường ñộ hô hấp theo thời gian khi xử lý 2,4-D hay xử lý phối hợp 2,4-D với BA ở các nồng ñộ khác nhau tương tự như lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc.
Trong các nghiệm thức chỉ bổ sung 2,4-D, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l (HN3) có CĐHH cao nhất (2,04µmol/g/giờ) (hình 3.6A).
Ở các nghiệm thức có bổ sung phối hợp 2,4-D với BA, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l phối hợp với BA 0,2mg/l (HN7) có CĐHH cao nhất (2,56µmol/g/giờ) (hình 3.6B).
Như vậy, CĐHH giảm dần theo sự giảm của nồng ñộ 2,4–D và BA trong môi trường nuôi cấy. Nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l kết hợp với BA 0,2mg/l (HN7) có CĐHH cao nhất.
3.2.4 Sự gia tăng trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mô sẹo ñược hình thành từ các nguồn mẫu
Hình 3.7: Sự gia tăng trọng lượng tươi và gia tăng trọng lượng khô giữa các nghiệm thức cho mô sẹo tốt nhất ở các nguồn mẫu
Sự gia tăng trọng lượng tươi và gia tăng trọng lượng khô của mô sẹo ñược hình thành từ lớp mỏng ñốt tử diệp ñược nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 2,4-D 1mg/l kết hợp với BA 1mg/l (nghiệm thức D9) là cao nhất (1,51g; 0,17g). Các nguồn mẫu còn lại, sự gia tăng trọng lượng tươi và gia tăng trọng lượng khô của mô sẹo giảm dần từ mô sẹo ñược hình thành từ lá (nghiệm thức L9) ñến lớp mỏng tử diệp (nghiệm thức T7), lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc (nghiệm thức HD8)và lớp mỏng trụ hạ diệp cắt ngang (nghiệm thức HD7) (Hình 3.7).
Tóm lại, từ những kết quả thu ñược, trong các nguồn mẫu (lá, lớp mỏng ñốt tử diệp, lớp mỏng tử diệp, lớp mỏng trụ hạ diệp diệp), lớp mỏng ñốt tử diệp ñược nuôi cấy trên môi trường bổ sung 2,4-D 1mg/l kết hợp với BA 1mg/l cho mô sẹo tốt nhất và nguồn auxin thích hợp cho sự hình thành mô sẹo là 2,4-D.
3.3 Sự phát sinh chồi
3.3.1 Sự hình thành và tăng trưởng của cụm chồi từ mô sẹo
Ở các nghiệm thức thuộc nhóm 1 (mô sẹo ñược cảm ứng trong 3 tuần trên môi trường bổ sung 2,4-D có hoặc không kết hợp với BA) không cảm ứng tạo chồi sau khi chuyển sang môi trường tạo chồi, mô sẹo tiếp tục phân chia thành khối mô sẹo lớn hơn.
Trong khi ñó, mô sẹo thuộc nhóm 2 (mô sẹo ñược cảm ứng trong 3 tuần trên môi trường có bổ sung AIA với nồng ñộ khác nhau kết hợp với BA 0,5mg/l) cho thấy sự xuất hiện chồisau khi cấy chuyền sang môi trường tạo chồi. Thời gian xuất hiện chồi tương ñối sớm (1tuần), số lượng chồi/cụm giảm dần theo sự tăng của nồng ñộ BA, nhưng chồi to hơn, chồi phát triển tốt (bảng 3.5a, b; ảnh 3.10, 3.11, 3.12).
Bảng 3.5a:Ảnh hưởng của BA lên sự hình thành chồi từ mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy.
Nghiệm thức Thời gian xuất
hiện chồi (tuần) Tỷ lệ tạo chồi (%) Số chồi/cụm
S0 1 16,67 ± 3,33a 1,00 ± 0,00a S1 1 33,33 ± 3,33abc 2,33 ± 0,00b S2 1 36,67 ± 3,33abc 2,67 ± 0,00c S3 1 43,33 ± 6,67bc 2,33 ± 0,00b S4 1 23,33 ± 8,82ab 2,00 ± 0,00b S5 1 26,67 ± 8,82abc 1,67 ± 0,00b S6 1 33,33 ± 3,33 abc 1,33± 0,00a S7 1 26,67 ± 6,67 ab 1,33 ± 0,00a
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%
Những nghiệm thức chỉ bổ sung BA, tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi không cao (16.67 – 43.33%), số lượng chồi/cụm thấp (1,00 – 2,67 chồi). Trong ñó, môi trường theo nghiệm thức có bổ sung BA 0,5 -1mg/l (S2, S3) cho tỷ lệ chồi và số chồi/cụm cao nhất (36,6 - 43,33%, 2,33 – 2,65 chồi/ cụm) (bảng 3.5a).
Bảng 3.5b:Ảnh hưởng của BA kết hợp với AIA 0,02 mg/l lên sự hình thành chồi từ mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy.
Nghiệm thức Thời gian xuất
hiện chồi (tuần) Tỷ lệ tạo chồi (%) Số chồi/cụm
S8 1 43,33 ± 1,33bc 3,33 ± 0,33c S9 1 53,33 ± 5,77c 7,67 ± 0,00e S10 1 43,33 ± 3,33bc 4,67 ± 0,00d S11 1 40,00 ± 1,33abc 2,67 ± 0,00c S12 1 43,33 ±3,33bc 3,33 ± 0,13c S13 1 43,33 ± 1,33bc 2,67 ± 0,33 S14 1 36,67 ± 3,33abc 2,33 ± 0,42
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%
Đối với các nghiệm thức có bổ sung BA kết hợp với AIA (0,02mg/l), tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi và số lượng chồi/cụm (36,67 – 53,33%; 2,33 – 7,67 chồi) cao hơn các nghiệm thức chỉ có bổ sung BA. Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi và số lượng chồi/cụm giảm dần theo sự tăng của nồng ñộ BA trong môi trường nuôi cấy. Môi trường theo nghiệm thức có bổ sung BA 0,5mg/l kết hợp với AIA 0,02mg/l (S9) có số lượng chồi, tỷ lệ tạo chồi cao nhất (53,33%; 7,67 chồi) (bảng 3.5a, b; ảnh 3.6, 3.7, 3.8).
Như vậy, trong sự hình thành chồi từ mô sẹo, các nghiêm thức có sự kết hợp giữa BA và AIA 0,02mg/l thích hợp cho sự phát sinh chồi từ mô sẹo của cấy mướp ñắng. Trong ñó, môi trường bổ sung BA 0,5mg/l kết hợp với AIA 0,02mg/l, chồi phát triển tốt nhất.
Ảnh 3.10: Chồi ñược hình thành và phát triển từ mô sẹo sau 1 tuần nuôi cấy, mũi tên xanh chỉ nốt tròn, mũi tên trắng chỉ chồi.
(A): môi trường MS ñối chứng (B): môi trường MS có bổ sung BA 0,5mg/l (C): môi trường MS có bổ sung BA 0,5mg/l và AIA 0,02mg/l
A B
C 1cm
1cm 1cm
Ảnh 3.11: Chồi ñược hình thành và phát triển từ mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy, mũi tên trắng chỉ chồi.
(A): môi trường MS ñối chứng (B): môi trường MS có bổ sung BA 0,5mg/l
(C): môi trường MS có bổ sung BA 0,5mg/l và AIA 0,02mg/l
A B C 1cm 0,6cm m 1 cm
Ảnh 3.12: Chồi ñược hình thành và phát triển từ mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy, mũi tên trắng chỉ chồi.
(A): môi trường MS ñối chứng (B): môi trường MS có bổ sung BA 0,5mg/l
(C): môi trường MS có bổ sung BA 0,5mg/l và AIA 0,02mg/l
A B
C
1,5cm
1,5cm
3.3.2 Sự thay ñổi hình thái trong quá trình phát sinh chồi
Dưới tác ñộng của chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh và nội sinh, các tế bào phía ngoài khối mô sẹo phân chia mạnh hình thành nên các trung tâm phân chia. Sau 1tuần, các trung tâm phân chia này tạo thành các nốt màu xanh và phân hóa thành phát thể chồi (ảnh 3.13).
Ảnh 3.13: Phẫu thức cắt ngang mô sẹo qua các nốt xanh (A), chồi ñược hình thành từ các nốt trên mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy (B), 15 ngày (C), mũi tên xanh chỉ nối xanh,mũi tên ñỏ chỉ
bó mạch, mũi tên vàng chỉ phát thể lá, mũi tên trẵn chỉ ñỉnh sinh trưởng.
A B
3.4 Sự phát sinh rễ
3.4.1 Sự hình thành và tăng trưởng rễ
Bảng 3.6:Ảnh hưởng của AIA lên sự hình thành và tăng trưởng rễ từ chồi sau 4 tuần nuôi cấy.
Nghiệm thức Thời gian xuất hiện rễ (tuần) Tỷ lệ tạo rễ sau (%) Số rễ/chồi
Chiều dài trung bình rễ (cm) R0 2 100 4,67 ± 0,88a 5,69 ± 0,84d R1 1,5 100 52,33 ± 1,76d 4,05 ± 0,26c R2 1,5 100 32,00± 1,76c 2,69 ± 0,10b R3 1,5 100 8,33 ± 0,67a 2,14 ± 0,11b R4 1,5 100 5,76 ± 0,67a 1,15 ± 0,10a
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%
(A) (B)
Hình 3.8:Sự hình thành rễ (A) tăng trưởng rễ (B) vàsau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường có và không và bổ sung AIA.
Các nghiệm thức không có bổ sung và có bổ sung AIA ñều tạo rễ.
Nghiệm thức không có bổ sung AIA (L0) có chiều dài trung bình rễ cao nhất (6,69 cm) nhưng số rễ ít (4,67) và thời gian xuất hiện rễ lâu nhất (2 tuần),(bảng 3.8, hình 3.8 ảnh 3.10A).
Ở các nghiệm thức có bổ sung AIA, số lượng rễ và chiều dài rễ giảm dần theo sự tăng của nồng ñộ AIA. Trong ñó, môi trường theo nghiệm thức có bổ sung AIA 0,2 mg/l (R1) cho số rễ/chồi cao nhất (52,33 rễ), cây phát triển tốt, rễ chắc (ảnh 3.10 B, C). Các nghiệm thức có nồng ñộ AIA 1 – 1,5mg/l, có sự hình thành mô sẹo trắng và xanh quanh vết cắt, rễ dễ bị ñứt, cây phát triển yếu hơn so với các nghiệm thức còn lại (ảnh 3.10 E, CF).
Như vậy, môi trường bổ sung AIA 0,2 mg/l là môi trường thích hợp nhất ñối với sự tạo rễ.
Ảnh 3.14:Rễ ñược hình thành sau 4 tuần tuổi nuôi cấy
A): môi trường MS ñối chứng, (B): môi trường MS có bổ sung AIA 0,2 mg/l, (C): môi trường MS có bổ sung AIA 0,5 mg/l, (D): môi trường MS có bổ sung AIA 1 mg/l, (E): môi trường
MS có bổ sung AIA 1,5 mg/l A 3 cm 2 cm 2 cm 2 cm 2 cm B C E D
3.2.2 Sự thay ñổi hình thái trong quá trình phát sinh rễ
Ở các nghiệm thức không bổ sung AIA (R0) và bổ sung AIA 0,2 – 0,5mg/l (R1, R2), các sơ khởi rễ bất ñịnh ñược hình thành từ vùng tượng tầng libe-mộc. Sau 2 tuần, các sơ khởi này kéo dài ñẩy nội bì và nhu mô vỏ ra ngoài (ảnh 3.15).
A
C B
Ảnh 3.15:Phẫu thức cắt ngang gốc thân cây mướp ñắng in vitro 0 ngày (A), 5 ngày (B), sơ khởi rễ kéo dài (C), rễ (D), nuôi cấy trên môi trường bổ AIA 0,5 mg/l, mũi tên trắng chỉ tượng tầng libe-mộc, mũi tên mũi xanh chỉ tế bào phân chia, tên mũi ñỏ chỉ sơ khởi rễ, mũi
tên tên vàng chỉ rễ kéo dài
3.5 Sự thích ứng của cây con in vitro ngoài vườn ươm
Bảng 3.7 Khả năng thích ứng của cây con in vitro ngoài vườn ươm
Tỷ lệ (%) cây sống Tình trạng cây sống Tình trạng cây chết
73.33% Cây sống, tăng trưởng tốt Cây héo lá, thân mất nước.
Các cây con in vitro ñược ñem trồng với giá thể trấu hun. Sau 2 tuần, cây tăng trưởng tốt, tạo rễ mới, lóng kéo dài. Tuy nhiêm, tỷ lệ sống còn thấp (73,33%).
Ảnh 3.16: Cây mướp ñắng ngoài vườn ươm
D
4 cm
4.1 Sự hình thành mô sẹo
4.1.1 Sự thay ñổi hình thái trong quá trình tạo sẹo
Dưới tác ñộng của auxin là 2,4–D hay AIA không kết hợp hoặc kết hợp với BA, các tế bào dưới biểu bì ở cả mặt trên và mặt dưới dọc theo gân lá, các tế bào lớp mỏng ñốt tử diệp, tử diệp, trụ hạ diệp ñều có dấu hiệu phản phân hóa và bắt ñầu phân chia mạnh mẽ ñể hình thành mô sẹo. Các tế bào ở các lớp mỏng của các nguồn mẫu tiếp xúc trực tiếp với môi trường ñược cảm ứng bởi chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh trước tiên nên mô sẹo ñược hình thành sớm và tăng sinh nhanh. Ở tuần thứ 2, các tế bào mô sẹo ở phía ngoài tách rời nhau làm mô sẹo trở nên xốp. Lúc này, các tế bào mô sẹo phía ngoài có dạng hình thay ñổi, chứa không bào to khác với tế bào phía bên trong có kích thước ñều nhau, tế bào chất ñậm ñặc, nhân to (những tế bào có thể phát sinh hinh thái) [8]. Các nhóm tế bào này tiếp tục duy trì sự phân chia và có tế bào chuyển dần sang