4. Ý nghĩa thực tiễn
1.2.3 Vai trò của các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật
1.2.3.1 Auxin
Auxin rất cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào nên nó có vai trò quan trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật. Auxin ñược tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá non ( là các nơi có sự phân chia tế bào nhanh). Sau ñó, auxin di chuyển hướng gốc tới rễ và tích tụ trong rễ [11].
Auxin ở nồng ñộ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ nhưng cản sự tăng trưởng của các sơ khởi rễ này [7]. Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các vitamin (như thiamin mà rễ không tổng hợp ñược), acid amin (như arginin), và nhất là các hợp chất ortho-diphenolic (như acid cafeic, acid chlorogenic) [11].
Auxin cảm ứng hoạt ñộng của mô phân sinh rễ, chất này di chuyển từ gốc ñến ngọn rễ và ñẩy mạnh sự phân chia tế bào tại ñây. Điều này cho thấy tác ñộng của auxin chủ yếu trong giai ñoạn phân chia tế bào chứ không phải suốt quá trình kéo dài rễ [15].
Trong số các loại auxin ñược sử dụng trong nuôi cấy in vitro, 2,4-D ñược xem là một auxin mạnh, có tác ñộng hình thành mô sẹo. Tuy nhiên nếu sử dụng nồng ñộ quá cao, auxin này sẽ gây ñộc cho tế bào, thậm chí gây biến ñổi di truyền. Trong sự hình thành sơ khởi rễ bất ñịnh, sử dụng NAA, AIA hay IBA thường ñược hiệu quả cao hơn so với 2,4-D. Tuy nhiên, tác ñộng của auxin ngoại sinh trong sự phát sinh hình thái cơ quan còn tùy thuộc vào trạng thái sinh lý cũng như hàm lượng chất ñiều hòa sinh trưởng nội sinh trong mô cấy. Trong suốt quá trình tạo rễ bất ñịnh, hàm lượng AIA tích lũy tăng cao. Điều này ñược giải thích là do auxin ngoại sinh ức chế hoạt ñộng của enzyme IAA oxidase và IBA có khả năng chuyển ñổi thành AIA. Do ñó cũng làm tăng nhanh lượng IAA nội sinh, kích thích sự hình thành rễ bất ñịnh [15].
1.2.3.2 Cytokinin
Trong thực vật, cytokinin ñược tổng hợp chủ yếu từ mô phân sinh ngọn rễ. Từ ñó chúng ñược vận chuyển trong mạch mộc tới chồi. Tuy nhiên, các chồi và phôi cũng là nơi tổng hợp cytokinin [11].
Ở rễ, cytokinin cản sự kéo dài nhưng kích thích tăng rộng tế bào [7]. Cytokinin ngăn cản sự lão hóa, thúc ñẩy sự trưởng thành của diệp lạp và là nhân tố chính ñiều khiển quá trình tái sinh mạch giúp cho sự tạo chồi [4]. Trong sự hình thành chồi,
cytokinin có thể ñược sử lý riêng rẻ hay phối hợp ñể làm tăng khả năng hình thành và chất lượng của chồi.
Ở nồng ñộ cytokinin cao giúp tạo thành cụm chồi. Số lượng chồi hình thành tùy thuộc vào nồng ñộ cytokinin. Cytokinin ở nồng ñộ thấp kích thích chồi nách phát triển. Nồng ñộ cao hơn sẽ cảm ứng hình thành chồi bất ñịnh nhưng chồi rất khó ra rễ.
Ở một số loài thực vật, mặc dù sự hình thành chồi ñược cảm ứng bởi cytokinin nhưng chồi không xuất hiện cho ñến khi mẫu ñược chuyển sang môi trường giảm hoặc không có cytokinin. Cytokinin cần cho giai ñoạn cảm ứng tạo chồi nhưng kìm hãm sự kéo dài của chồi. Những vấn ñề này có thể khắc phục bằng cách giảm nồng ñộ chất ñiều hòa sau vài lần cấy chuyền ñể chồi ñược phát triển tốt [15].
1.2.3.3 Sự phối hợp auxin và cytokinin trong phát sinh cơ quan
Auxin phối hợp với cytokinin giúp tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Tuy nhiên, ở nồng ñộ cao, auxin cản sự phát triển của phát thể chồi vừa thành lập hay của chồi nách [11].
Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, nhất là khi phối hợp với auxin. Cytokinin tác ñộng trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào. Dù hỗ trợ auxin trong sự tăng trưởng nhưng cũng có sự ñối kháng giữa cytokinin (giúp sự tạo chồi) auxin (giúp sự tạo rễ). Vì vậy, trong con ñường phát sinh hình thái thông qua mô sẹo, việc phối hợp cytokinin và auxin sẽ quyết ñịnh chiều hướng phát sinh hình thái. Miller và Skoog (1965) ñã chứng minh mô sẹo thuốc lá tạo rễ hay chồi tuỳ theo tỷ lệ auxin/cytokinin thấp giúp sự tạo chồi [11].
1.2.2.4 Giberelin
Giberelin kích thích sự kéo dài tế bào bởi cơ chế kiểm soát hướng ñặt của các vi sợi. Nó cũng có tác dụng kéo dài lóng do sự phối hợp hoạt tính kéo dài và phân chia tế bào thân. Giberelin kích thích mạnh sự phân chia tế bào nhu mô vỏ và biểu bì. Giberelin cũng có tác ñộng kích thích sự tăng trưởng chồi và gỡ sự ngủ của chồi.
Tuy nhiên giberelin có những ảnh hưởng khác nhau trên sự hình thành chồi trong nuôi cấy in vitro ở những loại thực vật khác nhau [11].
1.2.2.5 Acid abcisic (ABA)
ABA ñược xem là một nhân tố kìm hãm quá trình sinh lý, ñặt biệt là sự tăng trưởng của thực vật. Tuy nhiên, cũng như những hormon khác, tác ñộng kích thích hay kìm hãm quá trình sinh lý của ABA còn tuỳ thuộc vào nồng ñộ xử lý, và sự tương tác của ABA với những hormon khác [11].
1.2.2.6 Ethylen
Ethylen là nhóm chất ức chế, gây sự lão suy tế bào. Ethylen ñược hình thành từ tiền chất là SAM (S-adenosiylmethionin, trước ñó là methionin), thông qua các enzyme ACC-synthase, và ACC oxydase ñể biến ñổi lần lược thành ACC (acid l – amino-cyclopropan-l-carboxylic) và etylen. Hoạt tính của các chất trên dễ bị cản bởi một số hoá chất như: AVG (aminoethoxyvinylglincin), CoCl2 và AgNO3. AVG cản sự ñổi SAM thành ACC. Cobalt cản bước sau cùng ACC thành etylen. Ion Ag+ có tác ñộng cản hoạt ñộng của etylen [11].
ACC ức chế sự hình thành rễ bằng cách trì hoãn sự xuất hiện rễ và gia tăng sự hình thành mô sẹo ở gốc của chồi. Ngược lại, cả hai chất ức chế hoạt ñộng của etylen là AgNO3 và AVG ở nồng ñộ thích hợp ñều thúc ñẩy sự tạo rễ và làm giảm sự hình thành mô sẹo ở gốc của chồi. AgNO3 kích thích sự xuất hiện và sự tăng trưởng của rễ trong khi AVG gia tăng số rễ trên một chồi. CoCl2 làm tăng nhẹ số rễ và sự hình thành rễ. Những ảnh hưởng này là do sự giảm nồng ñộ etylen hoặc ức chế hoạt ñộng của etylen [15].
1.2.3 Một số yếu tố khác ảnh hưởng ñến sự phát sinh hình thái thực vật 1.2.3.1 Tuổi của mô cấy 1.2.3.1 Tuổi của mô cấy
Hiệu quả tác ñộng của các chất ñiều hoà tăng trưởng thực vật trên sự phát sinh hình thái phụ thuộc nhiều vào trạng thái sinh lý của mô cấy.
Ở nhiều loài, ñặc biệt ở cây thân gỗ, chồi bất ñịnh ñược hình thành một cách dễ dàng ở những mô trẻ từ các bộ phận của cây con mới nẩy mầm hơn những khúc cắt từ cây trưởng thành [4].
1.2.3.2 Ánh sáng
Ánh sáng có tác ñộng ñến sự tăng trưởng và khả năng phát sinh hình thái của tế bào trong nuôi cấy in vitro. Tuy nhiên mỗi loài thực vật khác nhau có những ñáp ứng khác nhau với từng loại ánh sáng, cường ñộ và thời gian chiếu sáng khác nhau. Thường sự hình thành rễ xảy ra trong tối [4].
1.2.3.3 Nhiệt ñộ
Trong nuôi cấy mô in vitro, mỗi loài thực vật khác nhau có những ngưỡng nhiệt ñộ tối hảo khác nhau. Đa số các loài hình thành chồi ở nhiệt ñộ 220C – 250C [4].
1.3Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước 1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Li Z. (2004) thuộc Trường ñại học Xihua ở Chengdu, Trung Quốc, nghiên cứu ñiều kiện nuôi cấy tối ưu mô sẹo mướp ñắng ghi nhận, trong môi trường MS có bổ sung casein 100mg, glucose 30g/l, BA 0,5mg/l, 2,4-D 0,2mg/l là ñiều kiện tối ưu cho sự hình thành mô sẹo [17].
Yang và cộng sự (2004) ghi nhận, khi nuôi cấy mô mướp ñắng cho ba loại mô sẹo khác nhau: mô sẹo vàng trong, vàng xanh và xanh. Những mô sẹo này tiếp tục nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BA 4,0mg/l và kinetin 2,0mg/l cho chồi bất ñịnh sau ba tuần nuôi cấy. Tỷ lệ chồi bất ñịnh hình thành trên từng loại mô sẹo khác nhau. 66,7% ñối với mô sẹo vàng xanh, rất thấp ở mô sẹo xanh (< 15,0%) thậm chí thấp hơn nữa, chồi bất ñịnh không hình thành trên mô sẹo vàng trong. Môi trường MS bổ sung zeatin 5,0mg/l và kinetin 0,5mg/l thích hợp cho phát sinh chồi, hệ số phát sinh là 5 - 6. Môi trường ½ MS và kinetin
0,02mg/l hoặc môi trường ½ MS sau 3 tuần nuôi cấy cho thân và rễ. Tỷ lệ sống sót khi ñem trồng là 70% [20].
Thiruvengadam và cộng sự (2006) nghiên cứu về sự tối ưu hoá hệ thống phát sinh phôi soma ở mướp ñắng cho thấy, sẹo bở mướp ñắng nuôi cấy trong môi trường MS lỏng bổ sung 2,4-D 1,5 mg/l cho phôi hình cầu (24,6%). Việc loại bỏ hoàn toàn 2,4-D ra khỏi môi trường kích thích hình thành nên phôi hình tim và hình cá ñuối. Từ tế bào soma hình thành nên tế bào tiền phôi, từ ñó phát triển thành phôi hình tim, hình cá ñuối trong vòng hai tuần trên môi trường MS không bổ sung chất ñiều hoà sinh trưởng. Nhưng nếu trong môi trường trên ñược bổ sung thêm PVP (polyvinylpyrrolidone) 50 mg/l và glutamine 40 mg/l, phôi soma ñược hình thành nhiều hơn và thường xuyên hơn [29].
Agarwal và cộng sự (2006) nghiên cứu sự tổng hợp flavonoid của mô sẹo và cây mướp ñắng trong nuôi cấy in vitro trên môi trường MS có bổ sung Auxin và cytokinin với các nồng ñộ khác nhau ghi nhận có 3 loại flavonoid. Hàm lượng tổng số flavonoid ở mô sẹo sau sáu tuần nuôi cấy là 2,90 mg/g, ở thân là 2,96 mg/g trọng lượng khô… [12].
Al Munsur1 và cộng sự (2009) nhân giống invitro mướp ñắng từ ñốt thân và rễ cây non sau 10 ñến 12 ngày gieo hạt trên môi trường MS có bổ sung BA kết hợp với 2,4-D hoặc NAA ghi nhận, mẫu ñốt thân cho tỷ lệ mô sẹo cao nhất (93,75%) khi nuôi cấy có bổ sung 2,4-D 1,0mg/l và BA 1,0mg/l. Mẫu cấy rễ cho tỷ lệ mô sẹo cao nhất (85,00%) với NAA 0,6 mg/l. Ngoài ra, bổ sung 2,4-D 1,0 mg/l và BA 1,0 mg/l tỷ lệ tái sinh chồi là 75,00% từ ñốt thân, chồi tái sinh ñạt chiều cao nhất (5,15cm) khi kết hợp BA 2,5 mg/l và IAA 0,2 mg/l. Không có sự tái sinh chồi từ mẫu cấy rễ ở bất kì sự kết hợp nào [13].
1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Nguyễn Bá và cộng sự (1992), bước ñầu xây dựng ñược quy trình nhân nhanh in vitro cây mướp ñắng và ñã ñưa ra trồng thử nghiệm cây mướp ñắng ở quy mô nhỏ [26].
2.1 Nội dung nghiên cứu
1- Tìm hiểu thời gian và nồng ñộ chất khử trùng thích hợp.
2- Môi trường & chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp (auxin, cytokinin) ñể tạo và tăng sinh mô sẹo.
3- So sánh phản ứng tạo mô sẹo giữa các nguồn mẫu cấy khác nhau (tử diệp, trụ hạ diệp, lá non,…).
4- Khảo sát sự tạo chồi (cụm chồi, tăng trưởng chồi) từ mô sẹo. 5- Khảo sát sự tạo rễ từ những chồi thu nhận.
6- Khảo sát khả năng thích ứng của con in vitro ngoài vườn ươm.
2.2 Vật liệu nghiên cứu
- Nguồn vật liệu: hột mướp ñắng do công ty GINO - Seed & Agriculture TP Hồ Chí Minh cung cấp. Hột giống có ñộ sạch ≥ 98%, tỷ lệ nảy mầm ≥ 80%, ñộ ẩm < 12%.
- Lớp mỏng tế bào ñược thu nhận từ các bộ phận khác nhau (Lá non, ñốt tử diệp, tử diệp, trụ hạ diệp) của cây in vitro 6 – 7 ngày tuổi nảy mầm từ hột mướp
ñắng (ñược nuôi trong ñiều kiện nhiệt ñộ 22 ± 20C, ñộ ẩm 55% ± 10%, ánh sáng 2000 lux ± 300lux).
- Trong các thí nghiệm, môi trường nuôi cấy ñược sử dụng là môi trường ña lượng và vi lượng theo thành phần khoáng của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) bổ sung thêm các thành phần:
+ Nước dừa 20%
+ Đường saccharose (nhà máy ñường Biên Hòa, Đồng Nai sản xuất): 20 g/l + Agar (công ty Hạ Long, Hải Phòng sản xuất): 5,8 - 6 g/l
+ Các chất ñiều hòa tăng trưởng tùy theo từng thí nghiệm: auxin (2,4-D, AIA), cytokinin (BA).
Môi trường ñược chỉnh pH = 5,8 (chỉnh bằng NaOH 1N và HCl 1N), ñược hấp khử trùng bằng autoclave ở nhiệt ñộ 121oC và áp suất 1 atm trong thời gian 20 phút.
Ảnh 2.1:Cây khổ qua 7 ngày tuổi (A), lá (B), tử diệp (C), ñốt tử diệp (D), trụ hạ diệp cắt dọc (1mm) (E), trụ hạ diệp cắt ngang (1mm) (F).
A F E D C B 1cm
2.3 Phương pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm ñược thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật - ĐH Khoa học Tự nhiên TP HCM và phòng thí nghiệm SHTV – ĐH Tây Nguyên.
Thời gian thực hiện: 11/2009 ñến 9/1010.
2.3.1 Thí nghiệm khử trùng hột mướp ñắng
- Dung dịch calcium hypochlorite có nồng ñộ thay ñổi từ 5 - 15% với thời gian khử trùng từ 10 - 20 phút.
- Dung dịch javel có hàm lượng chlor 38g/l (do cơ sở nước Javel Vân Phương, Quận 11, TP Hồ Chí Minh sản xuất) pha loãng tỷ lệ javel : nước là 1:0 và 1:1 (V:V) với thời gian khử trùng từ 10 - 20 phút.
- Dung dịch thuỷ ngân chlorite nồng ñộ 0,1% với thời gian khử trùng từ 5 - 15 phút.
Ghi nhận % mẫu sạch, sống sau 6 ngày khử trùng và gieo hạt.
2.3.2 Thí nghiệm tạo mô sẹo từ các nguồn mẫu của cây mướp ñắng
- Lá non cây in vitro 6 - 7 ngày tuổi ñược cắt thành mảnh khoảng 1cm2, tạo các vết thương (ảnh 2.1B).
- Tử diệp, ñốt tử diệp ñược cắt thành các lớp mỏng (0,5 - 1mm) theo chiều ngang (ảnh 2.1C, D).
- Trụ hạ diệp ñược cắt thành các lớp mỏng (0,5 - 1mm) theo chiều dọc, chiều ngang (ảnh 2.1 E, F).
Các mẫu này ñược ñặt trên môi trường MS có bổ sung chất ñiều hoà sinh trưởng thực vật: auxin (2,4-D hay AIA) có hoặc không có kết hợp với cytokinin (BA) ở các nồng ñộ thay ñổi như sau:
Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lá Bảng 2.1 a: Bố trí thí nghiệm Nghiệm thức 2,4-D (mg/l) L0 0 L1 0,2 L2 0,5 L3 1 Bảng 2.1 b: Bố trí thí nghiệm Nghiệm thức 2,4-D (mg/l) BA (mg/l) L4 0,2 0,2 L5 0,5 0,2 L6 0,5 L7 1 0,2 L8 0,5 L9 1 AIA (mg/l) BA (mg/l) L10 1 0,5 L11 2 0,5
Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp Bảng 2.2 a: Bố trí thí nghiệm Nghiệm thức 2,4-D (mg/l) D0 0 D1 0,2 D2 0,5 D3 1 Bảng 2.2 b: Bố trí thí nghiệm Nghiệm thức 2,4-D (mg/l) BA (mg/l) D4 0,2 0,2 D5 0,5 0,2 D6 0,5 D7 1 0,2 D8 0,5 D9 1 AIA (mg/l) BA (mg/l) D10 1 0,5 D11 2 0,5
Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng tử diệp Bảng 2.3 a: Bố trí thí nghiệm Nghiệm thức 2,4-D (mg/l) T0 0 T1 0,2 T2 0,5 T3 1 Bảng 2.3 b: Bố trí thí nghiệm Nghiệm thức 2,4-D (mg/l) BA (mg/l) T4 0,2 0,2 T5 0,5 0,2 T6 0,5 T7 1 0,2 T8 0,5 T9 1 AIA (mg/l) BA (mg/l) T10 1 0,5 T11 2 0,5
Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc Bảng 2.4 a: Bố trí thí nghiệm Nghiệm thức 2,4-D (mg/l) HD0 0 HD1 0,2 HD2 0,5 HD3 1 Bảng 2.4 b: Bố trí thí nghiệm Nghiệm thức 2,4-D (mg/l) BA (mg/l) HD4 0,2 0,2 HD5 0,5 0,2 HD6 0,5 HD7 1 0,2 HD8 0,5 HD9 1 AIA (mg/l) BA (mg/l) HD10 1 0,5 HD11 2 0,5
Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt ngang Bảng 2.5 a: Bố trí thí nghiệm Nghiệm thức 2,4-D (mg/l) HN0 0 HN1 0,2 HN2 0,5 HN3 1 Bảng 2.5 b: Bố trí thí nghiệm Nghiệm thức 2,4-D (mg/l) BA (mg/l) HN4 0,2 0,2 HN5 0,5 0,2 HN6 0,5 HN7 1 0,2 HN8 0,5 HN9 1 AIA (mg/l) BA (mg/l) HN10 1 0,5 HN11 2 0,5
Nuôi cấy trong tối ở 220C ± 20C, ñộ ẩm 55% ± 10%. Theo dõi biểu hiện của mẫu cấy, trọng lượng tươi, gia tăng trọng lượng tươi, gia tăng trọng lượng khô và cường ñộ hô hấp sau 2 - 5 tuần nuôi cấy. So sánh phản ứng tạo sẹo giữa các nguồn mẫu cấy và môi trường có nồng ñộ các chất ñiều hoà sinh trưởng khác nhau.
2.3.3Thí nghiệm tạo chồi từ mô sẹo và tạo rễ từ những chồi thu nhận
Tạo chồi từ mô sẹo
Mô sẹo ñược chia làm 2 nhóm: