5. Giới hạn đề tài
3.4. Thử nghiệm hoạt tính phân giải photphat khĩ tan của các chủng
sinh vật tuyển chọn trên nguồn photphat nhơm
Đất bazan nâu đỏ cĩ hàm lượng photphat tổng số rất giàu, nhưng photphat dễ tiêu rất thấp. Photphat khĩ tan chủ yếu tồn tại ở dạng photphat sắt và photphat nhơm (Nguyễn Tiến Sỹ, 2010). Theo Lê Hồng Lịch (2009) cơng bố thì trên 90% phân lân bĩn vào đất bazan đều bị cố định ở dạng khĩ tan. Chính vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra các chủng vi sinh vật cĩ khả năng phân giải photphat sắt và photphat nhơm cĩ ý nghĩa đặc biệt quan trọng.
Chúng tơi tiến hành thí nghiệm trên 2 lơ: lơ1 sử dụng Ca3(PO4)2 để làm đối chứng. Lơ 2 sử dụng AlPO4. Kết quả thể hiện trong bảng 3.7:
Bảng 3.7. Khả năng phân giải photphat khĩ tan của 3 chủng vi sinh vật được tuyển chọn trên nguồn photphat là Ca3(PO4)2 và AlPO4 .
Đơn vị: mgPO43-/l Nguồn photphat Ký hiệu chủng Ca3(PO4)2 AlPO4 XB1 12.05b 3.910c NĐ1 16.31a 9.100b NĐ2 9.78b 1.590c
( Các trị số cĩ các chữ cái giống nhau ở cùng một hàng khơng cĩ sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,01).
Qua bảng 3.7 cho thấy cả ba chủng tuyển chọn đều cĩ khả năng phân giải photphat khĩ tan trên nguồn photphat là AlPO4. Mặc dù hoạt tính phân giải trên nguồn photphat nhơm thấp hơn photphat canxi. Trong ba chủng tuyển chọn, cĩ chủng NĐ1 cĩ hoạt tính phân giải photphat nhơm cao nhất (9,1 mg PO43-/l). Kết quả này cao hơn nhiều so với nghiên cứu của Chang (2009) trên một số chủng nấm Aspergillus fumigatus và Streptomyces, Bacillus licheniformis cĩ hoạt tính phân giải AlPO4 từ 1-2mg/l [35]. Điều này rất cĩ ý nghĩa khoa học, cũng như thực tiễn. Kết quả thể hiện rõ trong biểu đồ 3.3:
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 XB1 NĐ1 NĐ2 Chủng vi sinh vật N ồ n g đ ộ P O 4 Ca3(PO4)2 ALPO4
Hình 3.3. Biểu đồ khả năng phân giải photphat khĩ tan của 3 chủng vi sinh vật được tuyển chọn trên nguồn photphat là Ca3(PO4)2 và AlPO4
3.5. Xây dựng qui trình nuơi cấy các chủng vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan XB1, NĐ1, NĐ2
3.5.1 Xác định mơi trường nuơi cấy thích hợp với sự sinh trưởng, phát triển cuả các chủng vi khuẩn XB1, NĐ1, NĐ2. triển cuả các chủng vi khuẩn XB1, NĐ1, NĐ2.
Để cĩ cơ sở khoa học cho việc giữ giống, nghiên cứu quy trình sản xuất và sử dụng các chế phẩm vi sinh vật phân giải photphat khĩ tan, cần phải nắm rõ các đặc điểm sinh học của các chủng và dinh dưỡng là một trong những đặc điểm đĩ. Dinh dưỡng là yêu cầu cần thiết đối với mọi lồi sinh vật sống. Vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan cũng vậy, các nguồn dinh dưỡng khác nhau đều ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Vì vậy, chúng tơi tiến hành nuơi cấy các chủng vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan XB1, NĐ1, NĐ2 đã được hoạt hĩa trên 3mơi trường là: Mơi trường NBRIP làm đối chứng và MT1(NBRIP nhưng nguồn nitơ là urê), MT2 (NBRIP nhưng nguồn cacbon là sascarose) để xác định mơi trường nào thích hợp hơn cho việc nhân sinh khối tế bào. Các thí nghiệm đều tiến hành ở nhiệt độ phịng thí nghiệm 26 - 280C và đặt trên máy lắc 150 vịng/phút, thời gian nuơi cấy là 60h .Sau đĩ lấy dung dịch nuơi cấy pha lỗng ở các nồng độ khác nhau (10-1 -10-8) rải 1ml dịch pha lỗng lên mơi trường NBRIP dạng thạch đĩa . Sau 2 đến 3 ngày tiến hành phân tích mật độ vi khuẩn bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc hình thành trên thạch đĩa theo phương pháp của Koch. Áp dụng cơng thức tính mật độ tế bào để xác định sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn XB1, NĐ1 và NĐ2, kết quả được trình bày ở bảng 3.8:
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của thành phần mơi trường nuơi cấy đến mật độ của các chủng vi khuẩn XB1, NĐ1và NĐ2 (CFU/ml)
Chủng vi khuẩn Mơi trường
NBRIP Mơi trường MT1 Mơi trường MT2 XB1 3.07x108 ab 1.56x108 bc 0.99x108c NĐ1 3.87x108 a 1.29x108 bc 1.31x108bc NĐ2 3.00x108 ab 1.10x108 c 1.05x108c
( Các trị số cĩ các chữ cái giống nhau ở cùng một hàng khơng cĩ sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,01).
Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy thành phần mơi trường đã ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, thể hiện trong biểu đồ hình 3.4.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 NBRIP MT1 MT2
Mơi trường nuơi cấy
M ậ t đ ộ v i s in h v ậ t( C F U /m l) XB1 NĐ1 NĐ2
Hình 3.4. Biểu đồ ảnh hưởng của thành phần mơi trường đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn đã lựa chọn
Như vậy cả 3 mơi trường đều cĩ mặt Ca3(PO4)2, đây chính là yếu tố giới hạn sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan.
Chỉ cĩ những vi khuẩn nào cĩ thể phân giải Ca3(PO4)2 thì mới cĩ khả năng tồn tại và phát triển, ngược lại sẽ bị đào thải. Mặt khác vi sinh vật cĩ thể sử dụng nitơ, cacbon từ nhiều nguồn khác nhau. Tuy nhiên, khơng phải nguồn nitơ, cacbon nào cũng thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Vì vậy, xác định nguồn nitơ cũng như nguồn cacbon thích hợp cho nuơi cấy vi sinh vật là rất cần thiết. Trong trường hợp này mật độ tế bào ở mơi trường NBRIP cao hơn so với 2 mơi trường kia cĩ thể do nguyên nhân là sự tổ hợp những yếu tố ở mơi trường NBRIP thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan hơn là tổ hợp những yếu tố trong mơi trường MT1 và MT2. Chính lí do này đã chi phối tạo nên một mơi trường thuận lợi giúp cho vi khuẩn tăng nhanh về sinh khối.
Dựa vào kết quả bảng 3.8 chúng tơi thấy rằng mơi trường NBRIP là mơi trường thích hợp cho việc nuơi cấy và thu sinh khối của các chủng vi khuẩn XB1, NĐ1 và NĐ2. Trong các thí nghiệm sau, chúng tơi chỉ sử dụng mơi trường NBRIP là mơi trường nhân giống nuơi cấy các chủng vi khuẩn XB1, NĐ1 và NĐ2.
3.5.2. Ảnh hưởng của pH mơi trường đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan XB1, NĐ1 và NĐ2 của các chủng vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan XB1, NĐ1 và NĐ2
Phản ứng của mơi trường cĩ ảnh hưởng khá rõ rệt đối với hoạt động sống của vi sinh vật. Giới hạn pH thích ứng của từng loại vi sinh vật rất khác nhau. Một số loại vi sinh vật cĩ thể phát triển trong các mơi trường axit, ngược lại cũng cĩ một số loại thích hợp với mơi trường cĩ pH trung tính hoặc mơi trường kiềm cho nên việc xác định pH thích hợp đối với vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan là điều cần thiết.
Bên cạnh đĩ, nồng độ các ion H+ và OH- ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình trao đổi chất của tế bào, làm ảnh hưởng đến diện tích bề mặt và mức độ hồ tan của một số muối khống (lân, kali, magiê, một số nguyên tố vi lượng). Ngồi ra, pH của mơi trường cịn ảnh hưởng đến
các sản phẩm hoạt động sống của vi sinh vật và đến quá trình sinh trưởng, phát triển của chúng, cho nên xây dựng pH thích hợp cho quá trình nhân nuơi vi khuẩn là rất quan trọng. Để thăm dị ảnh hưởng của pH mơi trường đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan XB1, NĐ1 và NĐ2 đã chọn, chúng tơi tiến hành nuơi cấy các chủng vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan đã chọn trên mơi trường nhân giống ở 5 mức pH khác nhau: 5,5 ; 6,0 ; 7,0 ; 7,5 và 8,0. Thí nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ phịng thí nghiệm 26 - 280C, tốc độ lắc 150 vịng/phút. Sau 60 giờ nuơi cấy, chúng tơi lấy dung dịch nuơi cấy đem pha lỗng ở các nồng độ khác nhau (10-1 – 10-8) rồi rải 1ml dịch pha lỗng lên mơi trường NBRIP dạng thạch đĩa. Sau 2 đến 3 ngày tiến hành phân tích mật độ vi khuẩn bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc hình thành trên thạch đĩa theo phương pháp của Koch. Áp dụng cơng thức tính mật độ tế bào để xác định sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn XB1, NĐ1 và NĐ2, kết quả được trình bày ở bảng 3.9:
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của pH mơi trường nuơi cấy đến mật độ của các chủng vi sinh vật XB1, NĐ1và NĐ2 (CFU/ml)
Kí hiệu chủng
pH của mơi trường nuơi cấy
5,5 6,0 7,0 7,5 8,0
XB1 0,82x108fg 1,22x108de 2,74x108b 1,26x108de 0.008x108h
NĐ1 0,92x108f 1,28x108de 2,99x108a 1,53x108de 0.009x108h
NĐ2 0,70x108g 1,33x108d 2,57x108c 1,15x108e 0.008x108h
( Các trị số cĩ các chữ cái giống nhau ở cùng một hàng khơng cĩ sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,01).
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 5.5 6 7 7.5 8 pH M ậ t đ ộ t ế b à o ( C F U /m l) XB1 NĐ1 NĐ2
Hình 3.5. Biểu đồ ảnh hưởng của pH mơi trường đến sinh trưởng và phát triển của 3chủng vi sinh vật phân giải photphat được tuyển chọn.
Từ kết quả ghi nhận được ở bảng 3.9, chúng tơi thấy rằng pH cĩ ảnh hưởng rõ rệt đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn XB1, NĐ1 và NĐ2.Cụ thể là mật độ tế bào vi khuẩn tăng dần từ pH = 5,5 đến pH = 6,0 và đạt số lượng mật độ tế bào cao nhất ở pH = 7,0, sau đĩ giảm dần khi pH = 7,5 và thấp nhất khi pH = 8,0.
Kết quả này hồn tồn phù hợp với kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả đĩ là vi khuẩn nĩi chung sinh trưởng và phát triển tốt ở mơi trường cĩ pH trung tính từ 6,5 đến 7,5. Vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan cũng nằm trong giới hạn đĩ khi chúng tơi nghiên cứu.
Và mặt khác, trong quá trình nghiên cứu chúng tơi tiến hành đo pH mơi trường sau 60 giờ nuơi cấy và nhận thấy rằng trong quá trình nuơi cấy thì pH mơi trường giảm rõ rệt, kết quả được ghi nhận ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Giá trị pH của dịch nuơi cấy vi khuẩn trong các mơi trường cĩ pH ban đầu khác nhau.
pH ban đầu pH sau nuơi cấy
XB1 NĐ1 NĐ2 5,5 4,61 4,93 4,79 6,0 4,76 4,56 4,81 7,0 5,53 4,60 4,43 7,5 5,40 5,01 4,58 8,0 5,00 5,40 5,10
Kết quả bảng 3.10 cho thấy trong quá trình nuơi cấy vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan , hoạt động của chúng đã tiết ra axit làm cho pH dung dịch giảm đi nhanh chĩng. Điều này chứng minh rằng vi khuẩn XB1, NĐ1, NĐ2 đã hoạt động mạnh mẽ trong quá trình phân giải photphat khĩ tan thành dễ tan.
Mặt khác các giá trị pH trong dịch nuơi cấy vi sinh vật giảm so với pH ban đầu, nhưng đều khơng thấp hơn 4, chứng tỏ các chủng vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan được lựa chọn nghiên cứu khơng gây axit hĩa mạnh cho mơi trường.
3.5.3. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn XB1 , NĐ1 và NĐ2 chủng vi khuẩn XB1 , NĐ1 và NĐ2
Vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan là lồi vi khuẩn kị khí khơng bắt buộc nên khi cĩ oxy chúng thực hiện quá trình hơ hấp hiếu khí giống như các vi sinh vật hiếu khí khác, vì thế nhu cầu về oxy của chúng là rất lớn. Nhờ oxy, vi khuẩn cĩ thể tiến hành các quá trình hơ hấp, trao đổi chất, trao đổi năng lượng với mơi trường bên ngồi. Vì vậy, hàm lượng oxy trong mơi trường sống cĩ ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của chúng.
Trong các thí nghiệm, các chủng vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan XB1, NĐ1 và NĐ2 được nuơi cấy ở mơi trường dịch thể, mơi trường này sẽ hạn chế việc sử dụng oxy của vi khuẩn. Khi nhân nuơi và thực hiện các thí nghiệm, các bình nuơi cấy luơn được lắc ở tốc độ 150 vịng/phút để cung cấp oxy hịa tan cho vi khuẩn. Tuy nhiên, để tìm hiểu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan XB1, NĐ1 và NĐ2, chúng tơi tiến hành nuơi cấy các chủng vi khuẩn trên mơi trường NBRIP lỏng, pH = 7 , nhiệt độ phịng thí nghiệm 26 – 28 oC và đặt ở 3 tốc độ lắc khác nhau là 100, 150, 200 vịng/phút. Sau 60 giờ nuơi cấy chúng tơi lấy dung dịch nuơi cấy đem pha lỗng ở các nồng độ khác nhau ( 10-1 - 10-8 ) rồi rải 1ml dịch pha lỗng lên mơi trường NBRIP dạng thạch đĩa. Sau 2 đến 3 ngày tiến hành phân tích mật độ vi khuẩn bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc trên thạch đĩa theo phương pháp của Koch. Áp dụng cơng thức tính mật độ tế bào để xác định sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn XB1, NĐ1 và NĐ2, kết quả được ghi nhận ở bảng 3.11:
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn XB1, NĐ1 và NĐ2
Kí hiệu chủng Mật độ vi khuẩn (CFU/ml) ở các tốc độ lắc
100rpm 150rpm 200rpm
XB1 1,28x109d 1,47x109cd 2,46x109ab
NĐ1 1,46x109cd 1,78x109bcd 2,80x109a
NĐ2 1,18x109d 1,34x109c 2,26x109ab
( Các trị số cĩ các chữ cái giống nhau ở cùng một hàng khơng cĩ sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,01)
Từ bảng 3.11 xây dựng biểu đồ về ảnh hưởng của tốc độ lắc đến mật độ của các chủng vi khuẩn.Ta thấy mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn phân
giải photphat tăng dần theo tốc độ lắc của bình nuơi và đạt cực đại ở 200 vịng/phút. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 100 150 200 Tốc độ lắc (v/p) M ậ t đ ộ v i s in h v ậ t (C F U /m l) XB1 NĐ1 NĐ2
Hình 3.6. Biểu đồ ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn
Như vậy vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan là lồi vi khuẩn kị khí khơng bắt buộc, nên khi được cung cấp oxy sẽ làm tăng khả năng trao đổi giữa cơ thể với mơi trường bên ngồi giúp vi khuẩn thuận lợi trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Từ đĩ dẫn đến sinh khối của chúng gia tăng. Mặt khác, khi nhân nuơi chúng trong mơi trường dịch thể sẽ dẫn đến sự hạn chế tiếp xúc giữa vi khuẩn và oxy, cho nên khi tốc độ lắc của bình càng cao sẽ làm cho khả năng hịa tan hàm lượng oxy trong dung dịch càng mạnh, vi khuẩn càng cĩ nhiều oxy cho quá trình hơ hấp, sinh trưởng và phát triển. Vì vậy, ở tốc độ lắc là 200 vịng/phút thì mật độ vi khuẩn đạt cao nhất khi chúng tơi khảo sát.Tuy nhiên, tốc độ lắc cũng cĩ một giới hạn nhất định cho nên cần tiếp tục nghiên cứu tăng tốc độ lắc cho phù hợp với mục đích và điều kiện nghiên cứu. Vì điều kiện thí nghiệm cĩ giới hạn nên chúng tơi chỉ nghiên cứu ở 3 tốc độ lắc 100, 150 và 200 vịng/phút .
3.5.4. Ảnh hưởng của thời gian nuơi cấy đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn phân giải photphat tuyển chọn của các chủng vi khuẩn phân giải photphat tuyển chọn
Mỗi lồi vi khuẩn sinh trưởng, phát triển theo một quy luật nhất định. Chính vì thế, khi nghiên cứu cần nắm rõ quá trình này để xác định các thời điểm thích hợp cho các cơng đoạn nghiên cứu tiếp theo. Để nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật đã lựa chọn chúng tơi tiến hành nuơi cấy chúng trong bình tam giác 250ml với các điều kiện nuơi cấy: mơi trường nuơi cấy NBRIP lỏng, pH = 7, nhiệt độ phịng thí nghiệm 26-28
o
C, tốc độ lắc 200 vịng / phút với các khoảng thời gian nuơi cấy 12h, 24h, 48h, 72h, 96h và 120h . Sau những khoảng thời gian nuơi cấy chúng tơi lấy dung dịch nuơi cấy pha lỗng ở các nồng độ khác nhau (10-1 - 10-8) rải 1ml dịch pha lỗng lên mơi trường NBRIP dạng thạch đĩa. Sau 2 đến 3 ngày tiến hành phân tích mật độ vi khuẩn bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc trên thạch đĩa theo phương pháp của Koch. Áp dụng cơng thức tính mật độ tế bào để xác định sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan XB1, NĐ1 và NĐ2.Kết quả thu được ở bảng 3.12:
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của thời gian nuơi cấy sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật phân giải photphat đã lựa chọn