5. Giới hạn đề tài
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng, địa điểm nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu:
Chủng vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan thu thập trên đất một số loại đất ở Đak Lak: đất bazan nâu đỏ (Rhode ferrasol), đất xám bạc màu, đất bazan dốc tụ.
Địa điểm nghiên cứu: Phịng thí nghiệm Bộ mơn Sinh học, Khoa Nơng Lâm nghiệp, Trường Đại học Tây Nguyên.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan phân giải photphat khĩ tan
+ Phương pháp lấy mẫu đất: Mỗi loại đất lấy 5 điểm khác nhau, trộn đều, mỗi điểm khoảng 100g, lấy từ lớp đất mặt đến 10cm. Mẫu được đựng trong túi nilon polypropylen đã được khử trùng. Các mẫu sau khi lấy được ghi nhãn nơi lấy, ngày lấy và người thu mẫu. Mẫu đất sau khi thu được đem ngay tới phịng thí nghiệm để tiến hành phân lập. Mẫu sau khi thu thập được phơi trong mát, đập nhỏ, qua rây 2mm.
+ Địa điểm lấy đất
Chọn 3 loại đất chủ yếu ở Đak Lak là:
- Đất bazan nâu đỏ lấy tại số 64 tỉnh lộ 8 đường đi Cư Mga, Tp. Buơn Ma Thuột.
- Đất xám bạc màu lấy tại thơn 11, xã Cư M’Lan, huyện Ea Soup. - Đất Bazan dốc tụ lấy tại thơn 8, xã Hồ Phú, Tp. Buơn ma Thuột.
+ Phương pháp phân lập
Mơi trường phân lập chủng vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan là mơi trường tối thiểu NBRIP (Perez, 2007)[44].
Thành phần mơi trường gồm:
5,0 g Ca3(PO4)2; 0,25g MgSO4; 0,2g KCl; 0,1g (NH4)2SO4;5 g MgCl2.6 H2O; 10g glucose; 20g agar tinh sạch; 1lit nước cất. Khử trùng ở 121oC trong 20 phút.
Khi phân lập vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan bằng cách nuơi cấy trên mơi trường NBRIP, vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan vẫn sống, sinh trưởng và phát triển được là do trong mơi trường NBRIP cĩ chứa Ca3(PO4)2 đây là một trong những loại lân khĩ tan. Vì vậy những khuẩn lạc mọc lên, sinh trưởng và phát triển tốt trên mơi trường NBRIP là những vi sinh vật cĩ khả năng phân giải lân khĩ tan thành lân dễ tan.
Tiến hành phân lập trên mơi trường NBRIP: Pha lỗng các mẫu đất đến nồng độ cần dùng. Hút 1 ml dịch mẫu đã pha lỗng cho vào đĩa petri
chứa mơi trường phân lập. Dùng que gạt thủy tinh đã vơ trùng phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch. Nhúng que gạt trong nước cất vơ trùng rồi hơ trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội rồi tiếp tục gạt mẫu cho đều khắp mặt thạch các đĩa petri tiếp theo. Dùng băng keo dán kín mép của cặp đĩa, đặt các đĩa petri đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 300C. Sau 3 - 5 ngày, quan sát hình thái và đếm số lượng khuẩn lạc của vi khuẩn.
Vi sinh vật phân giải hợp chất photphat khĩ tan được tính là số khuẩn lạc tạo vịng phân giải (vịng trịn trong suốt) bao quanh khuẩn lạc trên đĩa petri chứa mơi trường nuơi cấy đã chọn.
Đếm số lượng tế bào (CFU/ml) theo Trần Linh Thước (2007) [30]. Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa cĩ số đếm từ 25 – 250 khuẩn lạc để tính kết quả. Mật độ vi sinh vật phân giải photphat khĩ tan tổng số được tính theo cơng thức:
N
A ( CFU / ml ) =
n1Vf1 + ... niVfi
Trong đĩ:
A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc ) vi khuẩn trong một gram hay 1ml mẫu.
N: là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa petri đã chọn. ni: là số dĩa được giữ lại ở độ pha lỗng thứ i.
V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. fi: độ pha lỗng tương ứng.
* Phương pháp pha lỗng dung dịch
Chuẩn bị ống nghiệm: Lấy đủ ống nghiệm cho mục đích pha lỗng. Rửa sạch ống nghiệm và sấy khử trùng ở 1600C trong 2 giờ. Đặt ống nghiệm vào buồng cấy vơ trùng và bật đèn cực tím trong 30 phút.
Hút 9 ml nước cất vơ trùng cho vào các ống. Cân 1 g đất trồng khơ mịn cho vào 100 ml nước cất vơ trùng đã được hấp khử trùng. Hịa tan mẫu. Hút 1 ml dung dịch đã hịa tan cho vào ống thứ nhất, lắc đều. Sau đĩ, hút 1 ml dịch từ ống thứ nhất sang ống thứ hai rồi lắc đều và cứ như vậy tiếp tục hút sang các ống tiếp theo cho đến nồng độ cần pha. Sau khi được dung dịch cĩ nồng độ cần thiết ta tiến hành cấy ria mẫu lên các đĩa petri.
* Phương pháp bảo quản và giữ giống thí nghiệm
Bảo quản và giữ giống thí nghiệm bằng cách cấy truyền trong ống thạch nghiêng và đĩa petri. Dùng que cấy hơ trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, sau đĩ gạt nhẹ lên giống gốc rồi ria lên mặt thạch của ống và đĩa theo những hình dạng khác nhau. Dùng nút bơng đã khử trùng nút kín miệng ống, đầu ống được gĩi kín bằng báo đã được sấy khử trùng. Ghi ngày tháng cấy lên ống và đĩa, sau đĩ để vào tủ ấm 300C. Sau 3 - 5 ngày, khi vi khuẩn đã mọc đều và mạnh, gĩi bọc ống giống và để vào tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 2 - 50C. Các ống giống cĩ thể giữ được trong thời gian là 1 - 2 tháng và phải cấy truyền giữ giống trong khoảng thời gian đĩ.
* Phương pháp chuẩn bị giống thí nghiệm
Chuẩn bị các bình tam giác chứa 100 ml mơi trường NBRIP đã được khử trùng để hoạt hĩa giống. Dùng que cấy lấy giống từ các ống giống quấy nhẹ vào các bình tam giác cho vi khuẩn tan. Lắc đều bằng tay hoặc dùng máy lắc và để hoạt hĩa trong 24 giờ ở nhiệt độ phịng 26 - 280C. Khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo, sử dụng giống từ các bình này.
Lưu ý: Tất cả các dụng cụ đều phải vơ trùng và mọi thao tác phải được thực hiện trong box cấy vơ trùng.
2.2.2.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính phân giải photphat khĩ tan
Đánh giá hoạt tính phân giải photphat của các chủng vi sinh vật dựa trên nồng độ PO43-cĩ trong dịch nuơi cấy. Nồng độ PO43- càng cao chứng tỏ lượng photphat khĩ tan bị phân giải càng nhiều.
Xác định hàm lượng photphat bằng phương pháp Blue molipdate của Olsen và Somner (1982).
Nguyên tắc của phương pháp là ion PO43- sẽ phản ứng với (NH4)2SO4
tạo ra phức chất (NH4)2PO4.12MoO3 màu vàng. Trong mơi trường axit và cĩ ion Sn2+ phức màu vàng sẽ chuyển thành phức màu xanh (NH4)3(4MoO2.2MoO3):
PO43- + 12(NH4)2SO4 + 24H+ = (NH4)2PO4.12MoO3 + 21NH4+ + 12H2O. (NH4)2PO4.12MoO3 + Sn2+ + 16H+ = (NH4)3(4MoO2.2MoO3) + Sn4+ + 8H2O
Phức màu xanh cĩ bước sĩng hấp thụ cực đại ở 690nm. Sử dụng máy UV Vis đo ở bước sĩng 690nm để xác định độ hấp thụ màu của phức chất. Độ hấp thụ màu càng lớn chứng tỏ nồng độ ion PO4 càng cao.
Để tính tương quan giữa chỉ số mật độ quang (OD) và nồng độ PO4 cần thiết lập phương trình tương quan giữa hai chỉ số đĩ bằng KH2PO4.
Sử dụng dung dịch KH2PO4 5mg/l để pha dãy nồng độ theo bảng sau:
STT Nồng độ PO4 (mg/l) Thể tích KH2PO4 5mg/l (ml) Thể tích nước cất (ml) 1 0 0 100 2 0,1 2 98 3 0,2 4 96 4 0,3 6 94 5 0,4 8 92 6 0,5 10 90 * Thuốc thử
+ Dung dịch Molipdat amon trong H2SO4 10N
b, 25g Molipdat amon tinh thể tinh khiết hịa vào 200ml nước cất đem đun ở 60oC quấy đều, nếu cĩ cặn thì lọc tách để nguội.
Rĩt dung dịch Molipdat amon vào dung dịch axit, rĩt từ từ và khuấy đều sau khi nguội thêm nước cất thành 1 lit.
+ Dung dịch SnCl2.H2O
Lấy 2,5g SnCl2 hịa tan trong 24ml HCl (d=1,19) đem đun nĩng nhẹ, sau khi nguội thêm nước cất thành 100ml (Được dung dịch SnCl2 trong HCl 10% với nồng độ 25% SnCl2).
Thực hiện phản ứng xanh molipdate các nồng độ KH2PO4 rồi đo OD ở bước sĩng 690nm. Đường chuẩn và phương trình tương quan giữa chỉ số OD và nồng độ mg/l được xây dựng trên phần mềm Excel.
Chuẩn bị bình tam giác 250ml, mỗi bình chứa 50ml mơi trường NBRIP đã được khử trùng. Cấy các chủng vi sinh vật đã phân lập được vào và ủ 60h, nhiệt độ phịng thí nghiệm 26-28oC. Sau đĩ, lấy 1,5ml dịch mơi trường nuơi cấy đem ly tâm ở 6000rpm trong 10 phút. Hút cẩn thận 1ml dịch phía trên để làm phản ứng xanh molipdate : 1ml dịch nổi cộng với nước cất cho đủ 10ml. Sau đĩ thêm 0,4 ml molipdate và 1 giọt SnCl2 , lắc đều rồi để yên 5 phút cho bền màu. Đo OD ở bước sĩng 690nm, xác định nồng độ PO43-.
Chọn ra 3 chủng vi sinh vật cĩ hoạt tính phân giải photphat khĩ tan mạnh nhất để tiếp tục thí nghiệm.
2.2.2.3. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào
Tạo khuẩn lạc đơn trên đĩa thạch: sử dụng kỹ thuật ria chữ T (T streak), sau đĩ ủ ở 30oC trong 72h, quan sát hình thái khuẩn lạc ở vật kính 10x
Khuẩn lạc sẽ được xác định hình thái theo Nguyễn Lân Dũng (1979). Mơ tả các đặc điểm sau: hình dạng, kích thước, bề mặt, đặc tính quang học, màu sắc, mặt cắt ngang [8].
- Làm tiêu bản tế bào bằng thuốc nhuộm methyl blue và quan sát bằng kính hiển vi quang học ở độ phĩng đại 40x ,100x.
2.2.2.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính phân giải photphat khĩ tan của các chủng vi sinh vật tuyển chọn trên nguồn AlPO4 khĩ tan của các chủng vi sinh vật tuyển chọn trên nguồn AlPO4 khĩ tan
Sử dụng mơi trường NBRIP với nguồn photphat khĩ tan được thay đổi là AlPO4 (3,9g/l).
Thực hiện 2 lơ thí nghiệm:
- Lơ 1: sử dụng nguồn photphat khĩ tan là Ca3(PO4)2. Mơi trường được phân phối vào 9 ống nghiệm và mỗi ống chứa 10ml mơi trường, đem hấp khử trùng ở 121oC và 1atm. Cấy giống vi sinh vật vào các ống mơi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.
- Lơ 2: Sử dụng nguồn photphat khĩ tan là AlPO4. Mơi trường được phân phối vào 9 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml mơi trường, đem hấp khử trùng ở 121oC và 1atm. Cấy giống vi sinh vật vào các ống mơi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.
Sau 60h nuơi cấy, ở nhiệt độ phịng thí nghiệm khoảng 26 – 28oC, tiến hành thu dịch nổi mơi trường của các ống nghiệm để làm phản ứng xanh molipdate, xác định nồng độ PO4. So sánh hoạt tính phân giải photphat khĩ tan khi sử dụng AlPO4 với đối chứng là Ca3(PO4)2 ở lơ 1.
2.2.2.5. Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình nuơi cấy vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần mơi trường
- Lơ 1: Sử dụng mơi trường NBRIP. Mơi trường được phối vào 6 bình tam giác 250ml, mỗi bình chứa 100 ml mơi trường, đem hấp khử trùng ở 121oC và 1atm. Cấy các chủng vi khuẩn lựa chọn đã hoạt hĩa vào các bình mơi trường.
- Lơ 2: Sử dụng mơi trường NBRIP, tuy nhiên thành phần chứa nitơ được thay đổi. Nguồn nitơ sử dụng là urê (0,053g/l). Mơi trường được phân
phối vào 6 bình tam giác 250ml, mỗi bình chứa 100 ml mơi trường, đem hấp khử trùng ở 121oC và 1atm. Cấy các chủng vi khuẩn đã được hoạt hĩa vào các bình mơi trường.
- Lơ 3: Sử dụng mơi trường NBRIP, tuy nhiên thành phần chứa cacbon được thay đổi. Sử dụng nguồn cacbon là saccharose (10g/l). Mơi trường được phân phối vào 6 bình tam giác 250ml , mỗi bình chứa 100ml mơi trường, đem hấp khử trùng ở 121oC và 1atm. Cấy các chủng vi sinh vật đã được hoạt hĩa vào các bình mơi trường.
Sau 60h nuơi cấy ở nhiệt độ phịng (26 - 28 oC), tốc độ lắc 150 rpm, tiến hành phân tích mật độ vi khuẩn bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc hình thành trên thạch đĩa theo phương pháp của Koch. Thí nghiệm với ba lần lặp lại.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của vi khuẩn
Lựa chọn mơi trường thích hợp từ thí nghiệm trên, cùng một loại mơi trường nhân giống ta tiến hành chuẩn độ pH của mơi trường bằng cách sử dụng máy đo pH meter và hĩa chất chuẩn độ là KOH 1N và HCl 1N. Thí nghiệm pH cĩ 5 cơng thức và 3 lần lặp lại: 5,5; 6,0; 7,0; 7,5 và 8,0.
- Lơ 1: Mơi trường được điều chỉnh pH về giá trị 5,5 - Lơ 2: Mơi trường được điều chỉnh pH về giá trị 6,0 - Lơ 3: Mơi trường được điều chỉnh pH về giá trị 7,0 - Lơ 4: Mơi trường được điều chỉnh pH về giá trị 7,5 - Lơ 5: Mơi trường được điều chỉnh pH về giá trị 8,0
Mỗi lơ thí nghiệm, mơi trường được phân phối vào 6 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 10ml mơi trường. Sau đĩ hấp khử trùng ở 121oC và 1atm trong 20 phút, để nguội và cấy giống vi sinh vật đã hoạt hĩa vào 5 lơ.
Sau 60h nuơi cấy ở nhiệt độ phịng (26-28oC), tốc độ lắc 150 rpm, tiến hành phân tích mật độ vi khuẩn bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc hình thành trên thạch đĩa theo phương pháp của Koch và đo pH mơi trường sau nuơi cấy
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh trưởng của vi khuẩn
Chuẩn bị 3 lơ thí nghiệm, mỗi lơ thí nghiệm gồm 06 ống nghiệm. Phân phối vào mỗi ống nghiệm10ml mơi trường . Các điều kiện nuơi cấy khác là tối ưu từ các thí nghiệm trên. Đem hấp khử trùng ở 121oC, 1atm trong 20 phút, để nguội, cấy giống vi sinh vật đã hoạt hĩa vào các bình mơi trường. Mỗi lơ được lắc ở các tốc độ khác nhau:
- Lơ 1 : Lắc ở tốc độ 100rpm - Lơ 2 : Lắc ở tốc độ 150rpm. - Lơ 3 : Lắc ở tốc độ 200 rpm.
Chỉ tiêu theo dõi: Sau 60h nuơi cấy, tiến hành phân tích mật độ vi sinh vật bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc hình thành trên thạch đĩa theo phương pháp của Koch. Thí nghiệm với ba lần lặp lại.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuơi cấy
Chuẩn bị 6 bình tam giác 250ml. Phân phối vào mỗi bình tam giác 100ml mơi trường nuơi cấy. Các điều kiện nuơi cấy khác là tối ưu từ các thí nghiệm trên. Đem hấp khử trùng ở 121oC, 1atm, thời gian 20 phút. Cấy giống vi sinh vật vào các bình tam giác, mỗi giống cấy 2 bình. Các bình giống được nuơi cấy ở các khoảng thời gian 12h; 24h; 48h; 72h; 96h và 120h . Sau mỗi khoảng thời gian nuơi cấy tiến hành phân tích mật độ vi khuẩn bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc trên thạch đĩa theo phương pháp của Koch. Thí nghiệm được thực hiện với ba lần lặp lại.
2.2.2.6. Phương pháp xây dựng quy trình nuơi cấy vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan
Dựa vào kết quả của các nghiên cứu trong nội dung 2.2.2.5 để xây dựng mơi trường nuơi cấy thích hợp về các chỉ tiêu:
- Mơi trường nuơi cấy tối ưu - pH mơi trường tối ưu - Tốc độ lắc tối ưu
- Thời gian nuơi cấy tối ưu
2.2.2.7. Nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính phân giải photphat khĩ tan trên cây lúa trồng thí nghiệm trong chậu
Đối tượng nghiên cứu:
+Cây lúa (Oryza sativa), giống lúa ML 48.
+ Các chủng vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan tuyển chọn.
Lúa được gieo trong chậu (20 cây/chậu), 5 chậu đối chứng; 3 chủng chọn lọc được tiến hành thử nghiệm, mỗi chủng thử nghiệm cĩ 5 chậu thí nghiệm, sử dụng 20 ml (108 CFU/ml) dung dịch vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan tưới vào đất, chế độ chăm sĩc của tồn thí nghiệm là như nhau.
Đất sử dụng cho thí nghiệm trong chậu là lớp đất mặt (0-10cm), mỗi chậu cĩ khối lượng đất là 5 kg.
Sau 1 tháng , 2 tháng , 3 tháng lấy lá lúa đem phân tích hàm lượng N (phương pháp Kjieldahl), P tổng số (phương pháp so màu blue molipdate) và đo chiều cao của cây để so sánh sự sinh trưởng và phát triển của mỗi cơng thức.
Khi lúa chín sáp tính năng suất của lúa bằng cách cân khối lượng tuơi, khơ của tồn bộ sinh khối thân lá và rễ lúa và năng suất của mỗi chậu trong mỗi cơng thức.
2.2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu thống kê
Số liệu được phân tích thống kê theo phần mềm MSTATC version 2.10 của Đại học bang Michigan. Các số liệu được phân tích ANOVA và được trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,05 và 0,01.
Đồ thị tương quan và phương trình tương quan giữa chỉ số mật độ