5. Giới hạn đề tài
2.2.2.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính phân giải photphat
Đánh giá hoạt tính phân giải photphat của các chủng vi sinh vật dựa trên nồng độ PO43-cĩ trong dịch nuơi cấy. Nồng độ PO43- càng cao chứng tỏ lượng photphat khĩ tan bị phân giải càng nhiều.
Xác định hàm lượng photphat bằng phương pháp Blue molipdate của Olsen và Somner (1982).
Nguyên tắc của phương pháp là ion PO43- sẽ phản ứng với (NH4)2SO4
tạo ra phức chất (NH4)2PO4.12MoO3 màu vàng. Trong mơi trường axit và cĩ ion Sn2+ phức màu vàng sẽ chuyển thành phức màu xanh (NH4)3(4MoO2.2MoO3):
PO43- + 12(NH4)2SO4 + 24H+ = (NH4)2PO4.12MoO3 + 21NH4+ + 12H2O. (NH4)2PO4.12MoO3 + Sn2+ + 16H+ = (NH4)3(4MoO2.2MoO3) + Sn4+ + 8H2O
Phức màu xanh cĩ bước sĩng hấp thụ cực đại ở 690nm. Sử dụng máy UV Vis đo ở bước sĩng 690nm để xác định độ hấp thụ màu của phức chất. Độ hấp thụ màu càng lớn chứng tỏ nồng độ ion PO4 càng cao.
Để tính tương quan giữa chỉ số mật độ quang (OD) và nồng độ PO4 cần thiết lập phương trình tương quan giữa hai chỉ số đĩ bằng KH2PO4.
Sử dụng dung dịch KH2PO4 5mg/l để pha dãy nồng độ theo bảng sau:
STT Nồng độ PO4 (mg/l) Thể tích KH2PO4 5mg/l (ml) Thể tích nước cất (ml) 1 0 0 100 2 0,1 2 98 3 0,2 4 96 4 0,3 6 94 5 0,4 8 92 6 0,5 10 90 * Thuốc thử
+ Dung dịch Molipdat amon trong H2SO4 10N
b, 25g Molipdat amon tinh thể tinh khiết hịa vào 200ml nước cất đem đun ở 60oC quấy đều, nếu cĩ cặn thì lọc tách để nguội.
Rĩt dung dịch Molipdat amon vào dung dịch axit, rĩt từ từ và khuấy đều sau khi nguội thêm nước cất thành 1 lit.
+ Dung dịch SnCl2.H2O
Lấy 2,5g SnCl2 hịa tan trong 24ml HCl (d=1,19) đem đun nĩng nhẹ, sau khi nguội thêm nước cất thành 100ml (Được dung dịch SnCl2 trong HCl 10% với nồng độ 25% SnCl2).
Thực hiện phản ứng xanh molipdate các nồng độ KH2PO4 rồi đo OD ở bước sĩng 690nm. Đường chuẩn và phương trình tương quan giữa chỉ số OD và nồng độ mg/l được xây dựng trên phần mềm Excel.
Chuẩn bị bình tam giác 250ml, mỗi bình chứa 50ml mơi trường NBRIP đã được khử trùng. Cấy các chủng vi sinh vật đã phân lập được vào và ủ 60h, nhiệt độ phịng thí nghiệm 26-28oC. Sau đĩ, lấy 1,5ml dịch mơi trường nuơi cấy đem ly tâm ở 6000rpm trong 10 phút. Hút cẩn thận 1ml dịch phía trên để làm phản ứng xanh molipdate : 1ml dịch nổi cộng với nước cất cho đủ 10ml. Sau đĩ thêm 0,4 ml molipdate và 1 giọt SnCl2 , lắc đều rồi để yên 5 phút cho bền màu. Đo OD ở bước sĩng 690nm, xác định nồng độ PO43-.
Chọn ra 3 chủng vi sinh vật cĩ hoạt tính phân giải photphat khĩ tan mạnh nhất để tiếp tục thí nghiệm.