5. Giới hạn đề tài
2.2.2.4. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính phân giải photphat khĩ
Sử dụng mơi trường NBRIP với nguồn photphat khĩ tan được thay đổi là AlPO4 (3,9g/l).
Thực hiện 2 lơ thí nghiệm:
- Lơ 1: sử dụng nguồn photphat khĩ tan là Ca3(PO4)2. Mơi trường được phân phối vào 9 ống nghiệm và mỗi ống chứa 10ml mơi trường, đem hấp khử trùng ở 121oC và 1atm. Cấy giống vi sinh vật vào các ống mơi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.
- Lơ 2: Sử dụng nguồn photphat khĩ tan là AlPO4. Mơi trường được phân phối vào 9 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml mơi trường, đem hấp khử trùng ở 121oC và 1atm. Cấy giống vi sinh vật vào các ống mơi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.
Sau 60h nuơi cấy, ở nhiệt độ phịng thí nghiệm khoảng 26 – 28oC, tiến hành thu dịch nổi mơi trường của các ống nghiệm để làm phản ứng xanh molipdate, xác định nồng độ PO4. So sánh hoạt tính phân giải photphat khĩ tan khi sử dụng AlPO4 với đối chứng là Ca3(PO4)2 ở lơ 1.
2.2.2.5. Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình nuơi cấy vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần mơi trường
- Lơ 1: Sử dụng mơi trường NBRIP. Mơi trường được phối vào 6 bình tam giác 250ml, mỗi bình chứa 100 ml mơi trường, đem hấp khử trùng ở 121oC và 1atm. Cấy các chủng vi khuẩn lựa chọn đã hoạt hĩa vào các bình mơi trường.
- Lơ 2: Sử dụng mơi trường NBRIP, tuy nhiên thành phần chứa nitơ được thay đổi. Nguồn nitơ sử dụng là urê (0,053g/l). Mơi trường được phân
phối vào 6 bình tam giác 250ml, mỗi bình chứa 100 ml mơi trường, đem hấp khử trùng ở 121oC và 1atm. Cấy các chủng vi khuẩn đã được hoạt hĩa vào các bình mơi trường.
- Lơ 3: Sử dụng mơi trường NBRIP, tuy nhiên thành phần chứa cacbon được thay đổi. Sử dụng nguồn cacbon là saccharose (10g/l). Mơi trường được phân phối vào 6 bình tam giác 250ml , mỗi bình chứa 100ml mơi trường, đem hấp khử trùng ở 121oC và 1atm. Cấy các chủng vi sinh vật đã được hoạt hĩa vào các bình mơi trường.
Sau 60h nuơi cấy ở nhiệt độ phịng (26 - 28 oC), tốc độ lắc 150 rpm, tiến hành phân tích mật độ vi khuẩn bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc hình thành trên thạch đĩa theo phương pháp của Koch. Thí nghiệm với ba lần lặp lại.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của vi khuẩn
Lựa chọn mơi trường thích hợp từ thí nghiệm trên, cùng một loại mơi trường nhân giống ta tiến hành chuẩn độ pH của mơi trường bằng cách sử dụng máy đo pH meter và hĩa chất chuẩn độ là KOH 1N và HCl 1N. Thí nghiệm pH cĩ 5 cơng thức và 3 lần lặp lại: 5,5; 6,0; 7,0; 7,5 và 8,0.
- Lơ 1: Mơi trường được điều chỉnh pH về giá trị 5,5 - Lơ 2: Mơi trường được điều chỉnh pH về giá trị 6,0 - Lơ 3: Mơi trường được điều chỉnh pH về giá trị 7,0 - Lơ 4: Mơi trường được điều chỉnh pH về giá trị 7,5 - Lơ 5: Mơi trường được điều chỉnh pH về giá trị 8,0
Mỗi lơ thí nghiệm, mơi trường được phân phối vào 6 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 10ml mơi trường. Sau đĩ hấp khử trùng ở 121oC và 1atm trong 20 phút, để nguội và cấy giống vi sinh vật đã hoạt hĩa vào 5 lơ.
Sau 60h nuơi cấy ở nhiệt độ phịng (26-28oC), tốc độ lắc 150 rpm, tiến hành phân tích mật độ vi khuẩn bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc hình thành trên thạch đĩa theo phương pháp của Koch và đo pH mơi trường sau nuơi cấy
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh trưởng của vi khuẩn
Chuẩn bị 3 lơ thí nghiệm, mỗi lơ thí nghiệm gồm 06 ống nghiệm. Phân phối vào mỗi ống nghiệm10ml mơi trường . Các điều kiện nuơi cấy khác là tối ưu từ các thí nghiệm trên. Đem hấp khử trùng ở 121oC, 1atm trong 20 phút, để nguội, cấy giống vi sinh vật đã hoạt hĩa vào các bình mơi trường. Mỗi lơ được lắc ở các tốc độ khác nhau:
- Lơ 1 : Lắc ở tốc độ 100rpm - Lơ 2 : Lắc ở tốc độ 150rpm. - Lơ 3 : Lắc ở tốc độ 200 rpm.
Chỉ tiêu theo dõi: Sau 60h nuơi cấy, tiến hành phân tích mật độ vi sinh vật bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc hình thành trên thạch đĩa theo phương pháp của Koch. Thí nghiệm với ba lần lặp lại.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuơi cấy
Chuẩn bị 6 bình tam giác 250ml. Phân phối vào mỗi bình tam giác 100ml mơi trường nuơi cấy. Các điều kiện nuơi cấy khác là tối ưu từ các thí nghiệm trên. Đem hấp khử trùng ở 121oC, 1atm, thời gian 20 phút. Cấy giống vi sinh vật vào các bình tam giác, mỗi giống cấy 2 bình. Các bình giống được nuơi cấy ở các khoảng thời gian 12h; 24h; 48h; 72h; 96h và 120h . Sau mỗi khoảng thời gian nuơi cấy tiến hành phân tích mật độ vi khuẩn bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc trên thạch đĩa theo phương pháp của Koch. Thí nghiệm được thực hiện với ba lần lặp lại.
2.2.2.6. Phương pháp xây dựng quy trình nuơi cấy vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan
Dựa vào kết quả của các nghiên cứu trong nội dung 2.2.2.5 để xây dựng mơi trường nuơi cấy thích hợp về các chỉ tiêu:
- Mơi trường nuơi cấy tối ưu - pH mơi trường tối ưu - Tốc độ lắc tối ưu
- Thời gian nuơi cấy tối ưu
2.2.2.7. Nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính phân giải photphat khĩ tan trên cây lúa trồng thí nghiệm trong chậu
Đối tượng nghiên cứu:
+Cây lúa (Oryza sativa), giống lúa ML 48.
+ Các chủng vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan tuyển chọn.
Lúa được gieo trong chậu (20 cây/chậu), 5 chậu đối chứng; 3 chủng chọn lọc được tiến hành thử nghiệm, mỗi chủng thử nghiệm cĩ 5 chậu thí nghiệm, sử dụng 20 ml (108 CFU/ml) dung dịch vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan tưới vào đất, chế độ chăm sĩc của tồn thí nghiệm là như nhau.
Đất sử dụng cho thí nghiệm trong chậu là lớp đất mặt (0-10cm), mỗi chậu cĩ khối lượng đất là 5 kg.
Sau 1 tháng , 2 tháng , 3 tháng lấy lá lúa đem phân tích hàm lượng N (phương pháp Kjieldahl), P tổng số (phương pháp so màu blue molipdate) và đo chiều cao của cây để so sánh sự sinh trưởng và phát triển của mỗi cơng thức.
Khi lúa chín sáp tính năng suất của lúa bằng cách cân khối lượng tuơi, khơ của tồn bộ sinh khối thân lá và rễ lúa và năng suất của mỗi chậu trong mỗi cơng thức.
2.2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu thống kê
Số liệu được phân tích thống kê theo phần mềm MSTATC version 2.10 của Đại học bang Michigan. Các số liệu được phân tích ANOVA và được trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,05 và 0,01.
Đồ thị tương quan và phương trình tương quan giữa chỉ số mật độ quang OD và nồng độ PO43- được xử lý trên phần mềm EXCEL 2007 của Microsoft, các biểu đồ khác cũng được xử lý trên phần mềm này.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập các chủng vi sinh vật phân giải photphat khĩ tan
Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật phân giải photphat từ đất theo phương pháp nuơi cấy pha lỗng trên mơi trường đặc. Khi đĩ, các chủng vi sinh vật phân giải lân sẽ tạo vịng phân giải, tức là vịng trịn trong suốt bao quanh khuẩn lạc. Vịng phân giải được hình thành nhờ khả năng hịa tan hợp chất photphat khơng tan được bổ sung vào mơi trường nuơi cấy.
Trong phạm vi đề tài này, để phân lập vi sinh vật phân giải photphat khĩ tan chúng tơi sử dụng mơi trường phân lập là mơi trường NBRIP (Perez, 2007) [44].
Bảng 3.1. Mật độ vi sinh vật phân giải photphat khĩ tan ở ba mẫu đất
Mẫu đất Số khuẩn lạc ở các độ pha lỗng Tổng mật độ vi sinh vật (CFU/ml) 10-2 10-3 Xám bạc màu 129 32 14,8 x 104 157 38 Bazan nâu đỏ 95 25 9,3 x 104 75 28 Bazan dốc tụ 117 33 11,7 x 104 104 27
NBRIP là mơi trường tối thiểu vì cĩ chứa Ca3(PO4)2 là một loại photphat khĩ tan. Trong mơi trường này, để cĩ thể tồn tại và phát triển thì vi khuẩn phải cĩ khả năng phân giải hợp chất lân khĩ tan thành dạng dễ tan mới cĩ thể cung cấp được axit amin, tổng hợp protein cho cơ thể
chúng. Ở mơi trường NBRIP, vi sinh vật khơng được cung cấp bất kì nguồn lân dễ tan nào để sinh trưởng và phát triển, tất cả tùy thuộc vào khả năng phân giải của chúng. Chỉ cĩ những cá thể nào cĩ khả năng phân giải được Ca3(PO4)2 thì sẽ tồn tại và phát triển, ngược lại chúng sẽ bị đào thải.
Kết quả được nêu trong bảng 3.1 cho thấy tổng mật độ vi sinh vật cĩ khả năng phát triển trên mơi trường NBRIP của đất xám bạc ở Ea Soup đạt cao nhất 14,8 x 104 CFU/ml. Sau đĩ là ở Hịa Phú ( Buơn Ma Thuột) cĩ mật độ 11,7 x 104 CFU/ml. Cịn tổng mật độ vi sinh vật phân giải photphat trong đất đỏ bazan ở Buơn Ma Thuột thấp nhất: 9,3 x 104 CFU/ml. Kết quả này cũng tương tự như nghiên cứu của Hu (2009) trên một số loại đất của Trung Quốc. Tác giả cũng nghiên cứu cho thấy vai trị của phân hữu cơ đối với mật độ vi sinh vật phân giải photphat khĩ tan [40].
Các khuẩn lạc sẽ được phân loại sơ bộ dựa vào hình thái của khuẩn lạc và hình thái tế bào của vi sinh vật.
Bảng 3.2. Các chủng vi sinh vật phân giải photphat khĩ tan
Nhĩm vi sinh vật Ký hiệu chủng
Vi khuẩn XB1, XB2, XB3, XB4, NĐ1, NĐ2, NĐ3, NĐ4, DT1, DT2
Mẫu đất xám bạc màu ở Ea Soup phân lập được 4 chủng vi sinh vật. Mẫu đất bazan nâu đỏ ở thành phố Buơn ma Thuột được 4 chủng. Mẫu đất bazan dốc tụ ở xã Hịa Phú, Buơn Ma Thuột được 2 chủng. Như vậy, mẫu đất xám bạc màu và mẫu đất bazan nâu đỏ cĩ số lượng các chủng vi sinh vật phân giải photphat khĩ tan nhiều nhất.
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 10 chủng vi khuẩn phân giải photphat khĩ tan được mơ tả trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Hình thái khuẩn lạc của10 chủng vi sinh vật tuyển chọn
Ký hiệu chủng
Hình thái khuẩn lạc sau 3 ngày nuơi cấy
HD KT Bề mặt ĐT QH MKL Màu sắc MCN CT XB1 Trịn 2,5mm Trơn Đục Bằng phẵng Trắng Lồi Hạt lớn XB2 Trịn răng cưa 2 – 3 mm Ghồ ghề Đục Lượn Sĩng Nâu Lồi cong Hạt nhỏ XB3 Trịn 4 mm Ghồ ghề Đục Sợi Trắng Lồi cong Hạt nhỏ XB4 Trịn 1mm Ghồ ghề Đục Lượn Sĩng Vàng Phẳng Hạt nhỏ NĐ1 Trịn răng cưa 3mm Trơn Đục Bằng phẳng Trắng Lồi Hạt lớn NĐ2 Trịn 1,5mm Ghồ ghề Đục Lượn Sĩng Trắng Phẳng Hạt lớn NĐ3 Trịn 1,5mm Trơn Đục Sợi Trắng Lồi
cong Hạt nhỏ NĐ4 Trịn 1mm Trơn Đục Bằng phẳng Vàng nhạt Lồi cong Đồng nhất DT1 Trịn răng cưa 1,5cm Ghồ ghề Đục Lượn Sĩng Vàng nhạt Phẳng Đồng nhất DT2 Trịn 1mm Trơn Đục Bằng phẳng Trắng Lồi Hạt nhỏ
Ghi chú:HD: hình dạng; KT: kích thước; ĐTQH: đặc tính quang học; MCN: mặt cắt ngang; CT: cấu trúc.
3.2.Nghiên cứu đánh giá hoạt tính phân giải photphat khĩ tan của các chủng vi sinh vật
3.21. Xây dựng đường chuẩn và phương trình tương quan giữa chỉ số OD và nồng độ mg/l của dung dịch PO4
-3
Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng phương pháp blue molypdate để đánh giá khả năng phân giải photphat khĩ tan của các chủng vi sinh vật. Do đĩ việc dựng đường chuẩn và phương trình tương quan giữa chỉ số OD và nồng độ mg/l của dung dịch PO4-3 là cần thiết cho các đánh giá sau này cũng như cĩ thể so sánh kết quả của nghiên cứu này với các nghiên cứu khác. KH2PO4 được pha ở các nồng độ khác nhau rồi thực hiện phản ứng xanh molipdate. Kết quả thể hiện qua bảng 3.4 như sau:
Bảng 3.4. Chỉ số OD của các nồng độ KH2PO4 khác nhau STT Nồng độ KH2PO4 (mg/l) Chỉ số OD 690nm 1 0,5 0,872 2 0,4 0,699 3 0,3 0,513 4 0,2 0,355 5 0,1 0,163 6 0 0
Đường chuẩn và phương trình tương quan giữa chỉ số OD và nồng độ mg/l của dung dịch PO43- được thể hiện qua hình 3.1
ĐỒ THỊ ĐƯỜNG CHUẨN y = 1.7503x - 0.0039 R2 = 0.9996 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 0 0.2 0.4 0.6 NỒNG ĐỘ C H Ỉ S Ố O D Series1 Linear (Series1)
Hình 3.1. Đồ thị đường chuẩn của dung dich photphat
Theo đồ thị 3.1, phương trình tương quan giữa chỉ số OD và nồng độ mg/l của dung dịch PO4 là:
y = 1,7503x - 0,0039 Trong đĩ: x là nồng độ PO43- (mg/l).
y là chỉ số OD.
3.2.2. Đánh giá và tuyển chọn các chủng vi sinh vật cĩ hoạt tính phân giải photphat khĩ tan cao photphat khĩ tan cao
Các chủng vi sinh vật khác nhau cĩ khả năng phân giải photphat khĩ tan khơng giống nhau. Vì vậy, đánh giá khả năng phân giải của từng chủng là rất cần thiết. Chúng tơi tiến hành nuơi 10 chủng vi sinh vật trong mơi trường NBRIP lỏng trong 60h, sau đĩ xác định nồng độ PO4 được phân giải. Kết quả về khả năng phân giải photphat khĩ tan của 10 chủng vi sinh vật được ghi nhận trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Hoạt tính phân giải photphat khĩ tan của 10 chủng vi sinh vật STT Ký hiệu chủng Nồng độ PO4 mg/l 1 XB1 12,7b 2 XB2 7,92d 3 XB3 7,11e 4 XB4 7,62d 5 NĐ1 16,33a 6 NĐ2 10,71c 7 NĐ3 7,01e 8 NĐ4 6,11f 9 DT1 5,88f 10 DT2 7,013e
(Các trị số cĩ các chữ cái giống nhau ở cùng một cột khơng cĩ sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,01)
Qua kết quả bảng 3.5 chúng tơi xác định khả năng phân giải photphat khĩ tan của 10 chủng vi sinh vật như sau: khả năng phân giải photphat khĩ tan của 10 chủng vi sinh vật được chia thành 6 nhĩm theo thứ tự từ cao đến thấp: a, b, c, d, e, f. Trong đĩ nhĩm a cĩ chủng NĐ1 cĩ nồng độ PO4 phân giải cao nhất 16,33 mg/l, nhĩm b là chủng XB1cĩ nồng độ PO4 phân giải 12,7 mg/l, nhĩm c là chủng NĐ2 cĩ nồng độ PO4 phân giải là 10,71 mg/l. nhĩm d cĩ chủng XB2, XB4 cĩ nồng độ PO4 phân giải lần lược là 7,92mg/l, 7,62mg/l , nhĩm tiếp theo là nhĩm e cĩ các chủng XB3, NĐ3 , nồng độ PO4 phân giải khá thấp 7,11mg/l, 7,01mg/l. Nhĩm f gồm chủng NĐ4 và DT1 là nhĩm cĩ nồng độ PO4 phân giải thấp nhất 6,11mg/l và 5,88mg/l. Sự khác biệt về khả năng phân giải photphat khĩ tan của các chủng là cĩ ý nghĩa thống kê.
Kết quả nghiên cứu này tương đương với nghiên cứu của Vũ Thuý Nga và Nguyễn Ngọc Quyên (2003). Matias và cộng sự (2009) nghiên cứu khả năng phân giải photphat khĩ tan ở Brasil của các chủng nấm cĩ hoạt tính khá mạnh từ 20-60 mg PO43-/lit sau 5 ngày ủ. Hoạt tính phân giải photphate khĩ tan tuỳ thuộc vào chủng, sinh thái đất và chế độ canh tác [42]
Khả năng phân giải photphate khĩ tan của các chủng vi sinh vật được thể hiện qua biểu đồ 3.1:
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 XB1 XB2 XB3 XB4 NĐ1 NĐ2 NĐ3 NĐ4 DT1 DT2 Chủng vi sinh vât N ồ n g đ ộ P O 4 (m g /l ) Series1
Hình 3.2 Biểu đồ khả năng phân giải photphat khĩ tan của 10 chủng vi sinh vật
Như vậy đã xác định được 3 chủng vi sinh vật cĩ khả năng phân giải photphat cao là XB1, NĐ1, NĐ2 . Trong các thí nghiệm tiếp theo chúng tơi chọn các chủng này để làm đối tượng nghiên cứu.
3.3. Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật tuyển chọn Ba chủng vi
làm tiêu bản tế bào để xem trên kính hiển vi. Tiêu bản tế bào được quan sát ở vật kính 40x, 100x.
Bảng 3.6. Hình thái tế bào của 3 chủng vi sinh vật tuyển chọn được
Ký hiệu chủng
Hình thái tế bào sau 3 ngày nuơi cấy
Hình dạng Kích thước
NĐ2 Hình cầu 1 – 2µm