Keo tai tượng được đưa vào nước ta chậm hơn Keo lá tràm, từ những năm 80 của thế kỷ trước với sự tài trợ của các tổ chức quốc tế như UNDP, FAO, PAM, SIDA vv... Keo tai tượng cũng đã được nhập vừa để tham gia các khảo nghiệm loài, xuất xứ của các loài keo, vừa để phục vụ trồng rừng trên diện rộng ở nhiều vùng khác nhau. Ngày nay, bên cạnh việc nguồn giống ngày càng được cải thiện về chất lượng một phần thì diện tích trồng Keo tai tượng cũng được mở rộng ở hầu hết các tỉnh trong cả nước với khoảng 200000 ha tính đến năm 2006.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
So với cây Keo lá tràm Keo tai tượng có khả năng chị hạn và chịu lạnh kém hơn nhưng về sinh trưởng thì cây Keo tai tượng sinh trưởng nhanh hơn Keo lá tràm. Đặc điểm này ảnh hưởng đến phân bố của 2 loài cây này. Ở nước ta cây Keo tai tượng tường được trồng nhiều hơn ở các tỉnh vùng núi phía Bắc. Keo lá tràm được trồng nhiều hơn ở các tỉnh miền Trung.
Ở nước ta Keo tai tượng trồng thuần loài hoặc cũng có một số nơi được trồng hỗn giao với Bạch đàn, Phi lao, Trám,… nhưng chưa mấy thành công. Để tận dụng khả năng cải tạo đất của những loài cây có nốt sần cố định đạm tự nhiên, qua đó cung cấp dinh dưỡng cho cây, góp phần cải tạo đất, nên Keo tai tượng thường được trồng ở những nơi đất trống đồi núi trọc.
Có thể nói cây Keo tai tượng được trồng ở khắp nước ta. Diện tích đất tự nhiên toàn quốc thích hợp để trồng Keo tai tượng chiếm 23,3% có thể mở rộng 27,2%, ít thích hợp 49,6% (Nam 2010).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 2
VẬT LIỆU - NỘI DUNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Các chủng AM tham gia tuyển chọn được cung cấp từ các chủng vi sinh vật đã được nuôi thuần của đề tài cấp Nhà nước (2010-2013): “ Nghiên cứu sản xuất nấm rễ nội công sinh AM - Arbuscular mycorrhiza cho cây Lâm nghiệp”.
- Hạt giống bạch đàn, keo lá tràm, đất đóng bầu tầng B được cung cấp từ Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.
- Giá thể than bùn , cát vàng được nhập từ Viện Thổ nhưỡng Nông hóa.
- Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm được cung cấp từ Bộ môn Vi sinh, Viện Sinh thái và Môi trường rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.
2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3 năm 2012 đến tháng 12 năm 2013. Địa điểm nghiên cứu:
- Phòng thí nghiệmcủa Bộ môn Vi sinh vật, khu thí nghiệm nhà lưới của Viện Sinh thái và Môi trường rừng.
- Phòng thí nghiệm Đất của Viện Sinh thái và Môi trường rừng.
- Thí nghiệm bón nhiễm cho rừng trồng mớicây Bạch đàn, Keo lá tràm tạiCẩm Quỳ - Ba Vì - Hà Nội thuộc Viện nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.
- Thí nghiệm áp dụng bón chế phẩm AM cho rừng trồng sản xuất cây Bạch đàn, Keo lá tràm tại Tây Cốc- Đoan Hùng – Phú Thọ thuộc Công ty Lâm nghiệp Đoan Hùng – Tổng công ty Giấy Việt Nam.
2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu tuyển chọn các chủng AM và sản xuất chế phẩm nấm rễ nội cộng sinh AM cộng sinh AM
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Từ 11 chủng bào tử tốt nhất sau khi nuôi thuần tiến hành tuyển chọn 6chủng có khả năng sinh trưởng tốt, tỷ lệ cộng sinh cao và khả năng hấp thụ lân tốt trên đối tượng cây chủ Bạch đàn Uro và Keo lá tràm.
Chế phẩm và quy trình sản xuất chế phẩm nấm rễ nội cộng sinh AM tác giả kế thừa từ kết quả Đề tài cấp Nhà nước về “ Nghiên cứu sản xuất nấm rễ nội công sinh AM - Arbuscular mycorrhiza cho cây Lâm nghiệp” (Huy và CS. 2013)
2.3.2. Đánh giá ảnh hưởng bón nhiễm chế phẩm AM tới sinh trưởng Bạch đàn Uro và Keo lá tràm vườn ươm. đàn Uro và Keo lá tràm vườn ươm.
CTTN Hàm lƣợng AM (mg/cây)
ĐC 0
CT1 100
CT2 250
CT3 400
2.3.3Đánh giá ảnh hưởng bón nhiễm chế phẩm AM tới sinh trưởng Bạch đàn Uro và Keo lá tràm tại thí nghiệm rừng trồng mới.
CTTN Hàm lƣợng AM (mg/cây) ĐC 0 CT1 100 VU CT2 250VU CT3 400VU CT4 250RT CT5 250VU+250RT CT6 400VU+250RT CT7 400RT
2.3.4. Đánh giá ảnh hưởng áp dụng bónchế phẩm AM cho cây Bạch đàn Uro và Keo tai tượng tại rừng trồng sản xuất đại trà. và Keo tai tượng tại rừng trồng sản xuất đại trà.
CTTN Hàm lƣợng AM (mg/cây)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
CTTN 400RT
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Nghiên cứu tuyển chọn các chủng AM và sản xuất chế phẩm nấm rễ nội cộng sinh AM cộng sinh AM
a) Bố trí thí nghiệm tuyển chọn các chủng AM
Các chủng AM lấy từ các bầu nhân nuôi bào tử thuần. Đối với nghiên cứu tuyển chọn các chủng có tỷ lệ cộng sinh cao và chủng AM có khả năng tăng cường hấp thụ P, vật liệu AM cung cấp cho thí nghiệm là chất nhiễm từ bầu nhân nuôi bào tử thuần ( bào tử, rễ, sợi nấm) với chất lượng tương đương khoảng 10 bào tử AM/g đất. Thí nghiệm được tiến hành tại vườn ươm.Mỗi bầu thí nghiệm gồm 10g chất nhiễm. Giá thể dùng để nhân nuôi có thành phần là than bùn và cát với các tỷ lệ than bùn : cát = 3:1 đã được khử trùng sạch (1210C trong 1 giờ).
Mỗi chủng trên mỗi cây chủ được thực hiện lặp lại với 3 bầu và tiến hành trên 11 chủng và 1 đối chứng.Cây chủ được dùng trong phương pháp nghiên cứu là cây được gieo từ hạt đã được khử trùng. Chọn 2 đối tượng cây chủ cho mỗi chủng thí nghiệm nghiên cứu là : Bạch đàn (Eucalyptus urophylla) và Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Mỗi đối tượng thí nghiệm vào các bầu khác nhau.
Xử lý nảy mầm và đặt trên giấy lọc vô trùng.Từ nhóm thuần đã nhân nuôi in vivo chọn 50 - 60 bào tử nảy mầm tốt nhất.Đặt bào tử nảy mầm gần với rễ mầm của cây chủ.
Sau thời gian 1tuần, kiểm tra cộng sinh rễ- nấm trên kính hiển vi. Khi chắc chắn có cộng sinh thì cấy chuyển cây con trên bầu dung tích nhỏ (100g). Sau thời gian 1 tháng kiểm tra cộng sinh và bào tử hình thành trong giá thể. Chuyển sang bầu kích thước lớn (1-2kg giá thể). Sau khi kiểm tra chắc chắn có sự cộng sinh thì cây con và bào tử được chuyển ngay vào bầu có kích thước lớn. Thời gian tiến hành thí nghiệm: 6 tháng.
Chăm sóc, tưới dung dịch dinh dưỡng định kỳ, theo dõi thu thập các số liệu: sinh trưởng- sinh khối khô (rễ, thân, lá, tổng số), tỷ lệ cộng sinh, phân tích khả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
năng hấp thụ lân P2O5.
b)Tiêu chí tuyển chọn.
Chúng tôi tiến hành tuyển chọn với 3 tiêu chí: (i) Tỷ lệ cộng sinh AM rễ thực vật chủ: >60 %, (ii) Tăng cường khả năng hấp thụ lân (P2O5 của thực vật chủ >25 %, (iii) Tăng cường khả năng sinh trưởng thực vật chủ>50% (sinh khối khô).
Nguyên tắc tuyển chọn là: trước hết 3 tiêu chí được đánh giá độc lập, sau đó tổng hợp để tuyển chọn, chủng đồng thời đạt được tối thiểu 2 tiêu chí sẽ được tuyển chọn cho nghiên cứu nuôi cấy cộng sinh, nhân sinh khối AM in vitro và sản xuất chế phẩm AM .
Xác định Sinh khối khô:Rễ, thân, lá được làm sạch, để riêng từng phần, đưa vào tủ sấy ở 800
C sấy khô đến khối lượng không đổi, dùng cân kỹ thuật xác định sinh khối khô từng phần và tính sinh khối tổng số.
Xác định khả năng hấp thụ lân trong lá (P2O5 (%)): Sau kỳ thí nghiệm, thu 100(g) lá tươi (lá bánh tẻ)rửa sạch để ráo. Mẫu lá được gửi đi phân tích tại Phòng Phân tích thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên rừng, Viện Khoa học lâm nghiệp Việt Nam.
Tỷ lệ cộng sinh: cuối kỳ thí nghiệm rễ được thu hồi và nhuộm theo
phương pháp của (1999). Rễ nhuộm được đặt lên tiêu
bản cho xác định tỷ lệ nhiễm theo phương pháp của McGonigle (1990). Tổng số quan sát trên kính hiển vi tối thiểu là 100 lần quan sát trên toàn bộ mẫu. Ước lượng tỷ lệ nhiễ
).
Kế thừa phương pháp nghiên cứu AM của một số tác giả đã công bố trên thế giới.
Phương pháp nhuộm rễ ., 1999)
Bước 1: :
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
rửa sạch đất bám dưới vòi nước chảy (chú ý làm nhẹ nhàng để không làm đứt gãy các rễ mảnh của cây).
Rễ sau khi rửa cho vào các ống nghiệm thủ .
Đun sôi 800C. Bước 2: 10%: Đổ ống nghiệm đã đánh dấ ). 800 . ủ ừng quá trình ủ. . Bước 3: 1% 800 . . Bước 4: 0,5% . 800 . Bước 5: 50% . ủa toàn bộ , xác đị .
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
ỷ lệ nhiễm AM trong rễ (TheoMcGonigle, 1990)
Bước 1: :
/mẫu đất.
Bước 2: : Chọn điểm khởi đầu quan sát là góc cùng bên trái
hoặc bên phải của tiêu bản rễ ới chiề
ụ thuộc vào kích thước rễ, tuy nhiên cần đảm bảo tổng số thị trường quan sát cho một mẫu rễ lớ
.
Bước 3: : 4 nguyên tắc cho điể ản:
vỏ . ỏ . ỏ . ỏ . ỏ 1.
c) Sản xuất chế phẩm nấm rễ nội cộng sinh AM
Quy trình sản xuất chế phẩm nấm rễ nội cộng sinh AM tác giả kế thừa từ kết quả Đề tài cấp Nhà nước về “ Nghiên cứu sản xuất nấm rễ nội công sinh AM -
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 2.1. Quy trình sản xuất chế phẩm nấm rễ nội cộng sinh AM - Invitro
2.4.2. Thí nghiệm với cây Bạch đàn và Keo lá tràm ở vườn ươm
Sử dụng chế phẩm AM dạng bột bón cho các đối tượng thí nghiệm là Bạch đàn (Eucalyptus urophylla), Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Nghiên cứu được thực hiện với các thí nghiệm cụ thể như sau:
o CT1: Bón nhiễm chế phẩm dạng bột 100mg/bầu.
o CT2: Bón nhiễm chế phẩm dạng bột 250mg/bầu.
o CT3: Bón nhiễm chế phẩm dạng bột 400mg/bầu.
o Đối chứng: không bón nhiễm chế phẩm.
Bầu thí nghiệm kích thước 15x18cm (Thành phần ruột bầu:80% đất đồi + 15% phân hữu cơ Sông Giang + 5% NPK ( 15:5:8)). Chế phẩm được bón nhiễm vào thành phần ruột bầu vào thời điểm gieo hạt nảy mầm.
Kỹ thuật chất phụ gia (apatit,
than bùn)
Sinh khối AM invitro trong petri/bình trụ
Làm khôsinh khối làm nguyên liệu cho sản xuất chế phẩm
AM dạng bột và viên nén
Loại bỏ agar, thu hồi
Cắt nhỏ tạo nguyên liệu cho sản xuất chế
phẩm AM dạng viên gel Chế phẩm AM in vitro dạng bột Kỹ thuật chất kết dính tạo hạt AM + phụ gia Dập viên nén Chế phẩm AM in vitro dạng viên nén
Tạo viên gel với Sodium
alginate
Chế phẩm AM in vitro dạng viên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Mỗi công thức thí nghiệm với 100 cây, 5 lần lặp, mỗi lặp 20 cây được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn. Các thí nghiệm chỉ khác nhau về yếu tố thí nghiệm và đồng nhất về các yếu tố không thí nghiệm.
Thu thập số liệu định kỳ vào các thời gian sau 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng, 4 tháng, 5 tháng thí nghiệm.
2.4.3. Thí nghiệm bón nhiễm cho rừng trồng mới
ẩm Quỳ - – .Chế phẩm được
bón nhiễm ở rừng trồng bằng cách rải xuống lớp đất tiếp xúc trực tiếp với bầu cây trong khi trồng cây vào hố.
Thí nghiệm với 6 công thức khác nhau 1 đối chứng, bố trí theo khối ngẫu nhiên, mỗi công thức thí nghiệm với 50 cây, chia làm 3lần lặp, mỗi lặ
. :
Cây thí nghiệm tại rừng trồng là cây con 6 tháng tuổi. Các công thức thí nghiệm được tóm tắt trong bảng sau:
o ĐC: Không bón nhiễm chế phẩm AM in vitro.
o CT1: Bón nhiễm 100mg chế phẩm AM -in vitro tại vườn ươm.
o CT2: Bón nhiễm 250mg chế phẩm AM - in vitro tại vườn ươm.
o CT3: Bón nhiễm 400mg chế phẩm AM - in vitro tại vườn ươm.
o CT4: Bón nhiễm 250mg chế phẩm AM - in vitro tại rừng trồng.
o CT5: Bón nhiễm kết hợp: 250mg chế phẩm AM - in vitro tại vườn ươm + 250mg chế phẩm AM in vitro tại rừng trồng.
o CT6: Bón nhiễm kết hợp: 400mg chế phẩm AM -in vitro tại vườn ươm + 250 mg.
o CT7: Bón nhiễm 400mg chế phẩm AM - in vitro tại rừng trồng. Đo đếm thu thập các số liệu: sinh trưởng (Hvn, D0 .
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
: Tây Cố - – ộ
- ệt Nam.
Bảng 2.2 . Đặc điểm lập địa hiện trƣờng thí nghiệm bón nhiễm chế phẩm AM cho rừng trồng Keo và Bạch đàn
Địa điểm Cẩm Quỳ, Ba Vì Tây Cốc, Đoan Hùng
Độ dốc 1-2 o 15-18o
Thực bì Keo đã khai thác Keo đã khai thác Tầng đất >30-50 cm >50 cm
Đá lẫn 18-22 % 10-12 %
Màu sắc Nâu vàng Nâu vàng
Đá mẹ Sa phiến thạch Phiến thạch sét (Fs) Phẫu diện (cm) 0-20 20-40 0-20 20-40 Mùn (%) 2 .03 1.2 3,02 1,28 N (%) 0.22 0.12 0,25 0,16 P2O5 (mg/100g 4.12 2 .43 7.2,0 2,51 K2O (mg/100g 4.8 5.60 8,0 6,6 pHKCl 4.14 3.80 4,23 3,56 2 -0.02 mm(%) 31.1 26.3 25,6 31,8 0.02-0.002mm 36.1 25.3 38,2 36,1 <0.002mm 32.8 48.4 36,2 32,1 Nhóm dạng lập địa C C in vitro; in vitro. u cao Hvnvà đo D1,3 và D0 với Keo tai tượng
.
2.4.5. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nhỏ nhất là 0,1cm.
Đường kính gốc (Do (cm) D1.3 (m)): Được đo bằng thước kẹp Panmer có độ chia nhỏ nhất là 0,1cm. Do đo cách gốc 10 cm, D1.3 đo cách gốc 1,3 m.
Sinh khối khô: sau khi sấy khô đến khối lượng không đổi, cân xác định sinh khối khô bằng cân kỹ thuật.
Tỷ lệ cộng sinh: cuối kỳ thí nghiệm rễ được thu hồi và nhuộm theo
phương pháp của (1999). Rễ nhuộm được đặt lên tiêu
bản cho xác định tỷ lệ nhiễm theo phương pháp của McGonigle (1990). Tổng số quan sát trên kính hiển vi tối thiểu là 100 lần quan sát trên toàn bộ mẫu. Ước lượng tỷ lệ nhiễ
). Tính tỷ lệ cộng sinh theo công thức:
.
, OM % .
Independent samples t-test trong SPSS.
So sánh sự khác biệt giữa các công thức bằng phân tích phương sai 1 yếu tố, Test Post Hoc theo tiêu chuẩn Bonfferoni và Duncan trong SPSS.
Các giá trị trung bình và lập phương trình đường thẳng được thực hiện bởi phần mềm Excel 2010.
Số liệu sinh trưởng về chiều cao (H), đường kính (D) của Keo và Bạch đàn trên hiện trường trồng rừng được thu thập sau bón nhiễm 6 tháng và 12 tháng, bằng cách lập ô tiêu chuẩn đo đếm tại chân, sườn và đỉnh; mỗi ô thu 100 mẫu (10x10), mỗi thí nghiệm lập 3-4 ô đo đếm.
Trên cơ sở số liệu kết quả thu được trong các thí nghiệm bón nhiễm, tuyển chọn chúng tôi sử dụng SPSS 20 để phân tích xác định tương quan giữa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tỷ lệ cộng sinh AM trong rễ với chỉ số tăng cường hấp thụ Lân và với chỉ số tăng cường sinh trưởng (sinh khối khô).
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tuyển chọn các chủng AM trên đối tƣợng tuyển chọn Keo lá tràm và Bạch đàn. tràm và Bạch đàn.
Hình 3.1: Thí nghiệm tuyển chọn Bạch đàn Uro và Keo lá tràm.
Sau 6 tháng thí nghiệm trên 2 loại cây chủ: Keo lá tràm và Bạch đàn Uro chúng tôi tiến hành thu thập số liệu ( Hvn, Do) và phân lập mẫu giá thể trong các bầu đã tiến hành các thí nghiệm nhiễm AM trên các loại cây chủ trên. Kết quả phân tích được trình bày cụ thể trong Bảng 3.1 và Biểu đồ3.1 (a,b).