2.4.1. Nghiên cứu tuyển chọn các chủng AM và sản xuất chế phẩm nấm rễ nội cộng sinh AM cộng sinh AM
a) Bố trí thí nghiệm tuyển chọn các chủng AM
Các chủng AM lấy từ các bầu nhân nuôi bào tử thuần. Đối với nghiên cứu tuyển chọn các chủng có tỷ lệ cộng sinh cao và chủng AM có khả năng tăng cường hấp thụ P, vật liệu AM cung cấp cho thí nghiệm là chất nhiễm từ bầu nhân nuôi bào tử thuần ( bào tử, rễ, sợi nấm) với chất lượng tương đương khoảng 10 bào tử AM/g đất. Thí nghiệm được tiến hành tại vườn ươm.Mỗi bầu thí nghiệm gồm 10g chất nhiễm. Giá thể dùng để nhân nuôi có thành phần là than bùn và cát với các tỷ lệ than bùn : cát = 3:1 đã được khử trùng sạch (1210C trong 1 giờ).
Mỗi chủng trên mỗi cây chủ được thực hiện lặp lại với 3 bầu và tiến hành trên 11 chủng và 1 đối chứng.Cây chủ được dùng trong phương pháp nghiên cứu là cây được gieo từ hạt đã được khử trùng. Chọn 2 đối tượng cây chủ cho mỗi chủng thí nghiệm nghiên cứu là : Bạch đàn (Eucalyptus urophylla) và Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Mỗi đối tượng thí nghiệm vào các bầu khác nhau.
Xử lý nảy mầm và đặt trên giấy lọc vô trùng.Từ nhóm thuần đã nhân nuôi in vivo chọn 50 - 60 bào tử nảy mầm tốt nhất.Đặt bào tử nảy mầm gần với rễ mầm của cây chủ.
Sau thời gian 1tuần, kiểm tra cộng sinh rễ- nấm trên kính hiển vi. Khi chắc chắn có cộng sinh thì cấy chuyển cây con trên bầu dung tích nhỏ (100g). Sau thời gian 1 tháng kiểm tra cộng sinh và bào tử hình thành trong giá thể. Chuyển sang bầu kích thước lớn (1-2kg giá thể). Sau khi kiểm tra chắc chắn có sự cộng sinh thì cây con và bào tử được chuyển ngay vào bầu có kích thước lớn. Thời gian tiến hành thí nghiệm: 6 tháng.
Chăm sóc, tưới dung dịch dinh dưỡng định kỳ, theo dõi thu thập các số liệu: sinh trưởng- sinh khối khô (rễ, thân, lá, tổng số), tỷ lệ cộng sinh, phân tích khả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
năng hấp thụ lân P2O5.
b)Tiêu chí tuyển chọn.
Chúng tôi tiến hành tuyển chọn với 3 tiêu chí: (i) Tỷ lệ cộng sinh AM rễ thực vật chủ: >60 %, (ii) Tăng cường khả năng hấp thụ lân (P2O5 của thực vật chủ >25 %, (iii) Tăng cường khả năng sinh trưởng thực vật chủ>50% (sinh khối khô).
Nguyên tắc tuyển chọn là: trước hết 3 tiêu chí được đánh giá độc lập, sau đó tổng hợp để tuyển chọn, chủng đồng thời đạt được tối thiểu 2 tiêu chí sẽ được tuyển chọn cho nghiên cứu nuôi cấy cộng sinh, nhân sinh khối AM in vitro và sản xuất chế phẩm AM .
Xác định Sinh khối khô:Rễ, thân, lá được làm sạch, để riêng từng phần, đưa vào tủ sấy ở 800
C sấy khô đến khối lượng không đổi, dùng cân kỹ thuật xác định sinh khối khô từng phần và tính sinh khối tổng số.
Xác định khả năng hấp thụ lân trong lá (P2O5 (%)): Sau kỳ thí nghiệm, thu 100(g) lá tươi (lá bánh tẻ)rửa sạch để ráo. Mẫu lá được gửi đi phân tích tại Phòng Phân tích thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên rừng, Viện Khoa học lâm nghiệp Việt Nam.
Tỷ lệ cộng sinh: cuối kỳ thí nghiệm rễ được thu hồi và nhuộm theo
phương pháp của (1999). Rễ nhuộm được đặt lên tiêu
bản cho xác định tỷ lệ nhiễm theo phương pháp của McGonigle (1990). Tổng số quan sát trên kính hiển vi tối thiểu là 100 lần quan sát trên toàn bộ mẫu. Ước lượng tỷ lệ nhiễ
).
Kế thừa phương pháp nghiên cứu AM của một số tác giả đã công bố trên thế giới.
Phương pháp nhuộm rễ ., 1999)
Bước 1: :
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
rửa sạch đất bám dưới vòi nước chảy (chú ý làm nhẹ nhàng để không làm đứt gãy các rễ mảnh của cây).
Rễ sau khi rửa cho vào các ống nghiệm thủ .
Đun sôi 800C. Bước 2: 10%: Đổ ống nghiệm đã đánh dấ ). 800 . ủ ừng quá trình ủ. . Bước 3: 1% 800 . . Bước 4: 0,5% . 800 . Bước 5: 50% . ủa toàn bộ , xác đị .
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
ỷ lệ nhiễm AM trong rễ (TheoMcGonigle, 1990)
Bước 1: :
/mẫu đất.
Bước 2: : Chọn điểm khởi đầu quan sát là góc cùng bên trái
hoặc bên phải của tiêu bản rễ ới chiề
ụ thuộc vào kích thước rễ, tuy nhiên cần đảm bảo tổng số thị trường quan sát cho một mẫu rễ lớ
.
Bước 3: : 4 nguyên tắc cho điể ản:
vỏ . ỏ . ỏ . ỏ . ỏ 1.
c) Sản xuất chế phẩm nấm rễ nội cộng sinh AM
Quy trình sản xuất chế phẩm nấm rễ nội cộng sinh AM tác giả kế thừa từ kết quả Đề tài cấp Nhà nước về “ Nghiên cứu sản xuất nấm rễ nội công sinh AM -
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 2.1. Quy trình sản xuất chế phẩm nấm rễ nội cộng sinh AM - Invitro