Nguồn nitơ Hàm lượng (%) Nghiệm thức Hoạt tính (U/ml)
0,1 D1 25,80bcde 0,3 D2 26,52abcde 0,5 D3 25,87bcde NaNO3 0,7 D4 25,73bcde 25,98b 0,1 E1 25,39cde 0,3 E2 30,08a 0,5 E3 29,10abc NH4NO3 0,7 E4 29,33ab 28,47a 0,1 F1 23,52e 0,3 F2 23,63e 0,5 F3 25,15de NH4H2PO4 0,7 F4 27,71abcde 25,00b Đối chứng 0,0 DC 18,47f
Kết quả thống kê ở bảng 9 cho thấy các nguồn nitơ khác nhau bổ sung có ảnh hưởng khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Nguồn nitơ tốt nhất NH4NO3, các nguồn NaNO3 và NH4H2PO4 không khác biệt về mặt thống kê. Nhìn chung, việc bổ sung nguồn nitơ vào môi trường làm tăng khả năng tổng hợp enzyme amylase.
Đối với hai nguồn nitơ NaNO3 và NH4H2PO4, khi tăng hàm lượng từ 0,1-0,7% thì hoạt tính enzyme thay đổi khơng khác biệt ý nghĩa.
Ngược lại, sự thay đổi hoạt tính amylase đối với sự thay đổi hàm lượng NH4NO3 là có ý nghĩa thống kê, hàm lượngthích hợp đối với chất này là 0,3%, việc tăng hàm lượng bổ sung đến 0,7% khơng làm tăng hoạt tính. Trong q trình chuyền hóa của tế bào vi sinh vật thành các acid amin và các sản phẩm bậc 2, các gốc NH4+ và NO3- trong các muối amon và nitrate phải chuyển thành NH3, NH4NO3 có cả hai gốc này nên hiệu quả ảnh hưởng tương đối mạnh hơn các muối còn lại. NH4NO3 là nguồn nitơ vô cơ tốt cũng phù hợp với kết quả của Trần Tuyển Quang Phúc (2008). Còn theo kết quả nghiên cứu của Swetha Sivaramakrishman và cộng sự (2007) thấy rằng khi bổ sung NH4NO3 hoạt tính α-amylase tăng 1,1 lần và NH4H2PO4 làm giảm hoạt tính 1,6 lần so với đối chứng không bổ sung.
Như vậy, NH4NO3 là nguồn nitơ vô cơ tốt và hàm lượng thích hợp để bổ sung là 0,3%.
4.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng bổ sung riêng lẻ đến hoạt tính enzyme amylase được tổng hợp bời Asp.oryzae được tổng hợp bời Asp.oryzae
Các chất khống có vai trị quan trọng trong quá trình trao đổi chất ở vi sinh vật như chuyển hóa vật chất qua màng, điều hịa pH mơi trường ni cấy, nhóm ngoại đối với protein enzyme…
Bảng 10. Hoạt tính enzyme amylase theo nguồn khoáng bổ sung
Nguồn khoáng Hàm lượng (%) Nghiệm thức Hoạt tính (U/ml)
0,1 G1 24,41bc 0,3 G2 24,25bc 0,5 G3 20,73d KCl 0,7 G4 19,55d 22.23b 0,1 H1 24,56bc 0,3 H2 28,25a 0,5 H3 25,91ab CaCl2 0,7 H4 21,56cd 0,1 I1 25,00ab 25,07a 0,3 I2 24,92ab 0,5 I3 25,49ab MgSO4.7H2O 0,7 I4 24,36bc Đối chứng 0,0 DC 18,84d 24,94a
Ghi chú: các chữ cái khác nhau trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%
Kết quả thống kê ở bảng 10 cho thấy các nguồn khống bổ sung có ảnh hường đến hoạt tính enzyme và khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Trong đó, CaCl2 và MgSO4.7H2O được xem như những muối tốt không khác biệt thống kê và khác với KCl.
Hàm lượng bổ sung KCl đến 0,5 % thì hoạt tính enzyme giảm có ý nghĩa so với các nồng độ thấp hơn. KCl ở nồng độ cao hơn 0,5% làm ức chế sinh tổng hợp enzyme amylase.
Hàm lượng CaCl2 là 0,3% - 0,5% thì thích hợp, việc tăng thêm hàm lượng đến 0,7% khơng làm tăng hoạt tính enzyme amylase. Ca2+ là nhóm ngoại enzyme -amylase, bảo vệ enzyme trước các tác nhân gây biến tính và sự thủy phân của protease.
Đối với MgSO4.7H2O, tăng hàm lượng bổ sung từ 0,1- 0,7% khơng có khác biệt ý nghĩa về hoạt tính, Mg2+ ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzyme nên cũng được xem là nguồn khoáng tốt để bổ sung.
Febe Francis và cộng sự (2003) cũng chọn CaCl2 và MgSO4.7H2O để khảo sát ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme amylase, trong đó các nguồn khống bổ sung riêng lẻ với hàm lượng CaCl2 0,1%, MgSO4.7H2O 0,2%.
Tuy CaCl2 và MgSO4.7H2O đều là nguồn khoáng tốt cho sinh tổng hợp enzyme nhưng trong khoảng hàm lượng khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme đối với MgSO4.7H2O là khơng có ý nghĩa nên CaCl2 được chọn làm nguồn khống kết hợp với NH4NO3 ở thí nghiệm 4. Như vậy, hàm lượng khống bổ sung thích hợp là CaCl2 0,3% hoặc MgSO4.7H2O 0,1%.
4.4 Ảnh hưởng nguồn nitơ và khoáng bổ sung kết hợp đến hoạt tính enzyme amylase được tổng hợp bời Asp.oryzae amylase được tổng hợp bời Asp.oryzae
Các nguồn nitơ và khoáng đều ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme amylase nhưng tỉ lệ thích hợp giữa hai nguồn này thì ít được xem xét nên thí nghiệm đựợc bố trí kết hợp NH4NO3 và CaCl2 từ thí nghiệm 2 và 3.
Bảng 11. Hoạt tính enzyme amylase theo nguồn nitơ và khống bổ sung kết hợp Hàm lượng NH4NO3 (%) Hàm lượng CaCl2 (%) Nghiệm thức Hoạt tính (U/ml) 0,1 0,1 J1K1 25,74i 0,1 0,3 J1K2 33,91gh 0,1 0,5 J1K3 37,40efg 0,1 0,7 J1K4 37,73ef 0,3 0,1 J2K1 38,10ef 0,3 0,3 J2K2 38,75e 0,3 0,5 J2K3 40,12de 0,3 0,7 J2K4 43,29bcd 0,5 0,1 J3K1 42,54cd 0,5 0,3 J3K2 51,67a 0,5 0,5 J3K3 51,25a 0,5 0,7 J3K4 46,52b 0,7 0,1 J4K1 44,15bc 0,7 0,3 J4K2 33,48h 0,7 0,5 J4K3 33,84h 0,7 0,7 J4K4 34,93fgh 0 0 DC 25,96i
Ghi chú: các chữ cái khác nhau trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%
Theo kết quả thống kê bảng 11 cho thấy tỉ lệ bổ sung kết hợp giữa CaCl2 và NH4NO3 có ảnh hưởng đến hoạt tính amylase và khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Trong cùng một tỉ lệ NH4NO3, nếu tăng tỉ lệ CaCl2 hoạt tính enzyme cũng tăng theo. Nhưng ở tỉ lệ NH4NO3 0,5% thì CaCl2 tối ưu ở các nồng độ 0,3-0,5%. Kết quả cũng cho thấy ở nồng độ NH4NO3 0,7% thì khơng thuận lợi cho sự tổng hợp enzyme. Như vậy, NH4NO3 0,5% và CaCl2 0,3% là tỉ lệ kết hợp tốt giữa 2 nguồn này.
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 5.1 Kết luận
Qua thời gian nghiên cứu đề tài cho thấy việc bổ các nguồn dinh dưỡng carbon, nitơ, khoáng và sự kết hợp các nguồn này vào môi trường nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae làm tăng hoạt tính enzyme amylase được sinh tổng hợp.
Như vậy, nấm mốc Aspergillus oryzae sinh tổng hợp enzyme amylase cao trong môi trường cám, trấu ở nhiệt độ nuôi cấy 30oC, pH 5, độ ẩm 55% và nguồn carbon bổ sung thích hợp là lactose hàm lượng 5%; nguồn nitơ bổ sung thích hợp là NH4NO3 hàm lượng 0,3%; nguồn khống thích hợp là CaCl2 0,3% hoặc MgSO4.7H2O hàm lượng 0,1%; hàm lượng kết hợp tốt giữa NH4NO3 và CaCl2 là 0,5% NH4NO3 và 0,3% CaCl2.
5.2 Kiến nghị
Qua kết quả nghiên cứu, có một số kiến nghị như sau:
- Phân lập chủng nấm mốc Aspergillus oryzae thuần trên mơi trường ni cấy có bổ sung các thành phần như trên để chủ động nguồn giống trong nghiên cứu và sản xuất trong Bộ môn Công nghệ Thực phẩm.
- Khảo sát thêm nguồn acid amin và hàm lượng bổ sung như acid glutamic, tyrosine...và nguồn nitơ vô cơ như urê.
- Khảo sát nồng độ oxy thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme amylase theo phương pháp nuôi cấy bề mặt vì rất có thể hàm lượng oxy trong mơi trường càng cao thời gian ni cấy có thể rút ngắn và điều này cũng ảnh hưởng đến tỉ lệ trấu bổ sung.
- Khảo sát tương quan giữa hoạt tính protease và amylase trong dịch enzyme thơ, vì protease có thể thủy phân amylase.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Bùi Xuân Đồng (2004), Nguyên lý phòng chống nấm mốc và Mycotoxin, Nxb Khoa học Kỹ
thuật, Hà Nội.
Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn (2000), Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học, Nxb
Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội.
Chiêm Thị Bích Vân (2007), Nghiên cứu sản xuất chế phẩm amylase từ Aspergillus oryzae, Luận văn Tốt nghiệp Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
Dương Thị Hương Giang (2009), Giáo trình thực tập protein và enzyme học, Viện Nghiên
cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Đỗ Thị Tuyết Nhung (2005), Phân lập các giống nấm mốc hiện diện trên cam sành sau thu hoạch – Nghiên cứu biện pháp kiểm soát chúng trong thời gian bảo quản, Luận văn Thạc sĩ chuyên ngành công nghệ sinh.
Hồng Kim Anh, Ngơ Kế Sương và Nguyễn Xích Liên (2005), Tinh bột sắn và các sản phẩm
từ tinh bột sắn, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội.
Lê Ngọc Tú (2004), Hóa sinh cơng nghiệp, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội.
Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng và Lê Thị Lan Chi (2009), Các phương pháp phân tích ngành cơng nghệ lên men, Nxb Khoa học Kỹ
thuật, Hà Nội.
Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật công nghiệp, Nxb Xây Dựng, Hà Nội. Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. học, Trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Đức Lượng (2001), Công nghệ sinh học, Nxb Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí
Minh
Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ vi sinh vật (tập 2: Vi sinh vật học công nghiệp), Nxb Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Nguyễn Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương và Phan Thị Huyền (2004), Công nghệ enzyme, Nxb Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
Trần Tuyển Quang Phúc (2008), Khảo sát khả năng tổng hợp amylase từ Aspergillus oryzae
khi bổ sung muối cảm ứng, Luận văn Tốt nghiệp Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng
Tiếng Anh
Febe Francis, Abdulhameed Sabu, Madhavan Nampoothiri. K, Sumitra Ramachandran, Sanjoy Ghosh, George Szakacs and Ashok Pandey (2003), Use of response surface methodology for optimizing process parameters for the production of α-amylase by Aspergillus oryzae, Biochemical Engineering Journal, pp 108 -115
Swetha Sivaramakrishman, Dhaya Gangadharan, Kesavan Madhavan, Nam poothiri, Carlos Ricardo Soccol and Ashok Pandey (2007), Alpha amylase production by Aspergillus oryzae emloying solid state fermentation, Journal of Scientific & Industrial Research,
pp 621-626
Vasudeo Zambare (2010), Solid state Fermentation of Aspergillus oryzae for Glucoamylase
Production on Agro residues, International Journal of Life Sciences, pp 16-25
Esfahanibolandbalaie. Z, Rostami. K and Mirdamadi. S.S (2008), Some Studies of Alpha
amylase Production Using Aspergillus oryzae. Pakistan Journal of Biological
PHỤC LỤC A. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
Xác định hoạt tính enzyme amylase bằng phương pháp Nelson-Somogyi1 1. Nguyên tắc
Amylase thủy phân tinh bột cho ra các đường khử. Hoạt tính enzyme được xác định dựa vào lượng đường khử sinh ra thông qua phản ứng trung gian với thuốc thử Nelson-Somogyi.
2. Cách tiến hành
2.1 Dựng đường chuẩn glucose
Pha dung dịch đường chuẩn: chuẩn bị 6 ống nghiệm, cho vào mỗi ống thành phần
các chất theo bảng sau
Glucose (mM) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Dung dịch glucose (1mM) 0.0 ml 0.2 ml 0.4 ml 0.6 ml 0.8 ml 1.0 ml AmAc pH 5.0 1 ml 0.8 ml 0.6 ml 0.4 ml 0.2 ml 0.0 ml
Tổng thể tích 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Dựng đường chuẩn: chuẩn bị dãy 6 ống eppendorf (nghiệm thức lập lại ba lần 3x6)
Glucose (mM) 0.0 mM 0.2 mM 0.4m M 0.6 mM 0.8m M 1.0 mM Dung dịch glucose 150 µl 150 µl 150 µl 150 µl 150 µl 150 µl Thuốc thử đồng 150 µl 150 µl 150 µl 150 µl 150 µl 150 µl
Đun sơi 10 phút, để nguội ở nhiệt độ phịng
Thuốc thử Arseno-molybdate
150 µl 150 µl 150 µl 150 µl 150 µl 150 µl
Nước cất 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Ủ trong 20 phút. Ly tâm nếu có cặn, đo quang phổ ở bước sóng 520 nm 2.2 Ghi nhận kết quả vẽ biểu đồ đường chuẩn
Xác định hàm lượng đường khử trong sản phẩm thủy phân
1
a. Cho vào mỗi ống 50 µl tinh bột 1%+50 µl enzyme +50 µl đệm maleic. b. Ủ trong 30 phút ở 40oC.
c. Đối chứng: Lấy 5 ống eppendorf khác, dùng enzyme đã bất hoạt (đun nóng ở 100oC trong 30 phút) bố trí song song với thí nghiệm có enzyme chưa bất hoạt.
d. Xác định hàm lượng đường khử sinh ra trong mẫu theo đường chuẩn.
Tính tốn kết quả
Đơn vị hoạt tính enzyme trong 1ml enzyme được tính theo cơng thức
U: hoạt tính enzyme (U/ml)
X: hàm lượng glucose trong dung dịch đo T: thời gian phản ứng (30 phút)
VE: thể tích enzyme (50 µl) K: hệ số pha lỗng.
3. Phương pháp pha thuốc thử đồng
Hỗn hợp A1:A2 = 4:1
A1: hòa tan 15 g K-Na-tartrate.4H2O (Muối Rochelle) và 30g Na2CO3 (khan) với khoảng 300 ml H2O, thêm 20 g NaHCO3. Hòa tan 180 g Na2SO4 (khan) với khoảng 500 ml nước nóng và đun sơi để loại khí. Trộn 2 dung dịch trên sau khi làm nguội và hỗn hợp được thêm nước đến 1 lít.
A2: 5 g CuSO4.5H20 và 45 g Na2SO4 khan/250 ml nước.
4. Phương pháp pha thuốc thử Arseno-molybdate
Hỗn hợp B3:B4 = 1:2
B1: 26.5 g (NH4)6Mo7O24.4H2O/450 ml H2O. Vừa khuấy vừa thêm 21 ml H2SO4 đậm đặc.
B2: 3 g Na2HAsO4.7H2O/25 ml H2O.
B3: hòa trộn B1 và B2 với nhau, để trong tủ ủ ở 37oC trong thời gian từ 24 đến 48 giờ và bảo quản trong tối.
B4: 1.5N H2SO4 (41 ml H2SO4 đậm đặc/lít). E V T X * 1000 * U = ( ) * k
PHỤ LỤC B. CÁC KẾT QUẢ THỐNG KÊ
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của từng thành phần nguồn carbon (đường) bổ sung riêng
lẻ đến hoạt tính enzyme amylase được tổng hợp bởi Asp.oryzae Bảng phân tích phương sai cho hoat tính bởi nghiệm thức
----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 649.671 12 54.1393 6.39 0.0000 Within groups 220.297 26 8.47296
----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 869.968 38
Kiểm định cho hoạt tính bởi nghiệm thức
-------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD
nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------- DC 3 26.8974 X B1 3 33.6855 X B2 3 33.7876 X B4 3 34.5393 X A1 3 35.1146 XX A2 3 35.2519 XX B3 3 36.3773 XX C4 3 37.2388 XXX A4 3 37.4612 XXX C1 3 38.0444 XXX A3 3 39.8659 XXX C3 3 41.4628 XX C2 3 44.3696 X
Bảng phân tích phương sai cho hoạt tính bởi loại nguồn carbon
-----------------------------------------------------------------------------