Amyloid β peptid và đám rối amyloid β peptid gọi chung là các mục tiêu gắn kết. Trong phạm vi luận văn này các mục tiêu gắn kết được nghiên cứu là:
2.2.1 Cấu trúc đơn Aβ42 và Aβ40 trong môi trường nước- micelle
Aβ40 và Aβ42 chứa 40 và 42 acid amin. Cấu trúc bậc một (sequence) của Aβ42 là DAEFR HDSGY EVHHQ KLVFF AEDVG SNKGA IIGLM VGGVV IA và được lấy từ ngân hàng protein có ID 1Z0Q và được kí hiệu Aβ42-1Z0Q. Nếu ta bỏ đi hai acid amin cuối của Aβ42 thì ta thu được cấu trúc bậc một của Aβ40. Như vậy hai peptid này chỉ khác nhau 2 acid amin cuối nhưng rất khác nhau về hoạt tính. Thí dụ, Aβ42 có trong não ít hơn Aβ40 nhưng chúng tạo sợi nhanh hơn nhiều. Vì các peptid Aβ42 và Aβ40 tạo sợi rất nhanh trong nước nên các cấu trúc đơn của chúng trong môi trường nước chưa được
xác định bằng thực nghiệm. Do vậy, để tiến hành tính toán bằng phương pháp docking cho các đơn tử chúng tôi dùng cấu trúc lấy từ ngân hàng protein (PDB – Protein Data Bank). Các cấu trúc này được xác định trong môi trường nước-micelle. Đối với cấu trúc đơn của Aβ42 chúng tôi dùng cấu trúc lấy có mã số PDB ID là 1Z0Q (hình 2.2 B). Cấu trúc này sẽ được ký hiệu là Aβ42-1Z0Q.
Hình 2.2: (A) Cấu trúc đơn của Aβ40 lấy từ ngân hàng protein có ID là 1BA4 và được ký hiệu là Aβ40-1BA4; (B) Cấu trúc đơn của Aβ42 có ID là 1Z0Q và được ký hiệu là Aβ42-1Z0Q.
Đối với cấu trúc đơn Aβ40 trong ngân hàng protein có 2 cấu trúc có sẵn với PDB ID là 1AML[86] và 1BA4[19]. Cấu trúc 1AML thu được trong môi trường nước- micelle có độ pH=2.8, trong khi 1BA4 thu được trong môi trường có pH=5.1. Do vậy chúng tôi chọn cấu trúc 1BA4 (hình 2.2 A) làm đối tượng nghiên cứu vì độ pH ở đây gần với pH của nước. Cấu trúc này được ký hiệu là Aβ40-1BA4.
2.2.2 Cấu trúc đơn của Aβ40 trong nước.
Hình 2.3: Năm cấu trúc cuộn ngẫu nhiên của Aβ40 theo thứ tự từ trên xuống, từ trái qua: WT-Aβ40-1, WT-Aβ40-2, WT-Aβ40-3, WT-Aβ40-4 và WT-Aβ40-5. Hình cuối là tổ hợp của 5 cấu trúc.
Vì các thực nghiệm của GS Y-C Chen về ảnh hướng của các dẫn suất VK3 lên quá trình tạo sợi của Aβ40 được thực hiện trong nước nên chúng tôi phải tiến hành các tính toán đối với các đơn tử Aβ40 trong môi trường này. Nhưng như đã nói ở trên, cấu trúc đơn của Aβ40 trong nước chưa được xác định bằng thực nghiệm. Để khắc phục khó khăn này luận văn sẽ dùng các cấu trúc thu được bằng phương pháp động lực học phân tử (MD - molecular dynamice) bởi các tác giả khác (Ngô Sơn Tùng và M.S. Li, chưa công bố). Các tác giả này đã làm như sau. Đầu tiên cấu trúc lấy từ PDB có ID là 1BA4 (hình 2.2A) được sử dụng như cấu hình xuất phát để chạy mô phỏng MD trong 5 ns (5 nano giây) ở nhiệt độ T = 500 K cho đến khi đạt đến cấu trúc ngẫu nhiên (random coil structures). Trường lực (force field) GROMOS96 43a1 (xem phía dưới) trong nước tường minh (explicite water). Sau đó cấu trúc cuộn ngẫu nhiên này được dùng làm cấu hình đầu tiên cho quá trình mô phỏng MD 300 ns ở nhiệt độ T = 310 K. Các cấu hình nhận được ở trạng thái cân bằng được phân loại bằng phương pháp clustering[101][103] dựa trên độ lệch quân phương (RMSD – root mean square displacement) của các nguyên tử C. Với độ chính xác của RMSD là 1 Å họ đã thu được 5 cụm (cluster).[101] Các cấu hình đặc trưng của các cụm này được vẽ trên hình 2.3 và chúng được ký hiệu là WT-Aβ40-1, WT-Aβ40-2, WT-Aβ40-3, WT-Aβ40-4 và WT-Aβ40-5. Cả 5 cấu hình này được dùng làm mục tiêu gắn kết để thực hiện tính toán docking. Năng lượng liên kết là trung bình năng lượng liên kết thu được cho 5 cấu hình mục tiêu gắn kết. Vì tính toán bằng phương pháp MD tốn nhiều thời gian nên chúng tôi dùng WT-Aβ40-5 là cấu hình khả dĩ nhất (có xác suất xuất hiên cao nhất) làm mục tiêu gắn kết cho các tính toán bằng phương pháp MM-PBSA. Lưu ý rằng WT-Aβ40-1, WT-Aβ40-2, WT-Aβ40-3, WT-Aβ40-4 không có cấu trúc bậc hai. Chỉ có WT-Aβ40-5 có 17,5% cấu trúc β và 82,5% cấu trúc cuộn ngẫu nhiên (random coil).
2.2.3 Cấu trúc sợi nhị xứng 12Aβ9-40 vàtam xứng 18Aβ9-40
Thực nghiệm đã chứng minh rằng 8 acid amin đầu của peptid Aβ1-40 không có cấu trúc (unstructured) nên khi xây dựng mô hình sợi người ta bỏ qua chúng.[7] Sợi của Aβ9-40 có hai dạng là nhị xứng và tam xứng[7]. Ở đây chúng tôi nghiên cứu cấu trúc nhị xứng có 12 peptid (12Aβ9-40 ) và cấu trúc tam xứng có 18 peptid (18Aβ9-40 ). Nhóm thực nghiệm của GS Tycko (NIH, USA) đã cung cấp các cấu trúc này (hình 2.4).
Hình 2.4: Hai cấu trúc sợi trưởng thành của Aβ40, nhị xứng 12Aβ9-40 (A) và tam xứng 18Aβ9-40 (B). Hai cấu trúc này do nhóm thực nghiệm của GS Tycko (NIH, USA) cung cấp.
2.2.4 Cấu trúc sợi nhị xứng 5Aβ17-42
Trong trường hợp Aβ1-42 16 acid amin đầu tiên không có cấu trúc [93]. Do đó người ta xây dựng mẫu sợi cho phầnAβ17-42 . Đểtiến hành mô phỏng chúng tôi sử dụng cấu trúc nhị xứng có 5 peptid được ký hiệu là 5Aβ17-42 . Mẫu này được lấy từ PDB với ID là 2BEG (hình 2.5).
Tóm lại, ta có 10 mục tiêu gắn kết: hai cấu trúc đơn Aβ40-1BA4 và Aβ42- 1Z0Q trong môi trường micelle lấy trực tiếp từ ngân hàng PDB (hình 2.2); 5 cấu trúc đơn WT-Aβ40-1 - WT-Aβ40-5 (hình 2.3) thu được trong nước bằng mô phỏng động lực học phân tử; và ba cấu trúc sợi 12Aβ9-4 ,18Aβ9-40 (hình 2.4) và 5Aβ17-42
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT
3.1 So sánh năng lƣợng liên kết của các mục tiêu gắn kết khác nhau.
Năng lượng liên kết được xác định như năng lượng của kiểu docking (mode docking) tốt nhất. Trong trường hợp WT-Aβ40 ta có 5 thụ thể nên
∆Ebind được xác định như trung bình của các năng lượng docking thấp nhất. Các kết quả tính toán được trình bày trên bảng 3.1.
Hình 3.1: Biểu đồ năng lượng liên kết của các dẫn xuất VK3 với các mục tiêu gắn kết. Năng lượng liên kết của 12Aβ9-40 với các dẫn xuất VK3 là nhỏ nhất trong các mục tiêu gắn kết, kế tiếp là 18Aβ9-40 .
Năng lượng liên kết của các dẫn xuất VK3 với hai mục tiêu gắn kết 12Aβ9-40 và 18Aβ9-40 nhỏ hơn các mục tiêu gắn kết còn lại (hình 3.1). Có thể đó là do hai mục tiêu gắn kết này có cấu trúc không gian thuận tiện hơn các mục tiêu gắn kết khác (hình 3.2 và 3.3). Cấu trúc không gian tạo điều kiện cho các dẫn xuất VK3 dễ tiến sâu vào trong cấu trúc mục tiêu gắn kết, từ đó tăng diện tích mặt tiếp xúc giữa dẫn xuất VK3 và mục tiêu gắn kết dẫn tới tăng tương tác van der Waals, và các tương tác khác chính điều này đã làm ái lực liên kết tăng lên. Tuy nhiên, nếu chỉ dựa vào cấu trúc không gian thì không giải thích được vì sao năng lượng liên kết của 12Aβ9-40 nhỏ hơn năng lượng liên kết của 18Aβ9-40 . Đối với 12Aβ9-40 thì dẫn xuất VK3 tiến sâu vào bên trong để tạo liên kết hơn là ở trường hợp 18Aβ9-40 do các mảng sắp xếp theo một trật tự khác nhau, điều đó cho thấy sự liên kết của dẫn xuất VK3 và mục tiêu gắn kết có liên quan đến việc sắp xếp của các mảng đám rối.
Xét tính tương quan về năng lượng liên kết của 5 mục tiêu gắn kết Aβ40-1BA4, Aβ42-1Z0Q, 5Aβ17-42, 12Aβ9-40 và 18Aβ9-40 so với WT-Aβ40, rõ ràng chỉ có 3 mục tiêu là có sự tương quan tốt trong số 5 mục tiêu gắn kết: Aβ40-1BA4 tương quan tốt nhất với Hình 3.2: Cấu trúc không gian 12Aβ9-40 , vị trí
liên kết nằm sâu hơn so với 18Aβ9-40. Vẽ đại diện với phối tử VK3-9 màu đỏ.
Hình 3.3: Cấu trúc không gian 18Aβ9-40, vị trí liên kết nằm ngoài biên hơn so với 12Aβ9-40. Vẽ đại diện với phối tử VK3-9 màu đỏ.
WT-Aβ40 với hệ số tương quan R=0.91, kế đó 12Aβ9-40 hệ số tương quan 0.78, và 18Aβ9-
40 có hệ số tương quan 0.7 .
Hình 3.4: Biểu đồ tương quan năng lượng liên kết của Aβ40-1BA4, Aβ42-1Z0Q, 5Aβ17-42, 12Aβ9-40 và 18Aβ9-40 với mục tiêu gắn kết WT-Aβ40. Hệ số tương quan lớn nhất R=0.91 (Aβ40-1BA4), nhỏ nhất R=0.08 (5Aβ17-42). Năng lượng liên kết thu được bằng phương pháp docking.
Vậy thì từng thụ thể khác nhau thì có quy luật gắn kết khác nhau, riêng đối với những thụ thể có sự tương quan tốt với WT-Aβ40 (Aβ40-1BA4, 12Aβ9-40 , 18Aβ9-40) thì khi tính năng lượng liên kết bằng phương pháp MM-PBSA của các dẫn xuất VK3 với WT-Aβ40-5 thì ta có thể ngoại suy ra sự gắn kết của dẫn xuất VK3 với các thụ thể Aβ40-1BA4, 12Aβ9-40, 18Aβ9-40, cũng cùng quy luật như thụ thể WT-Aβ40-5.
Bảng 3.1: Năng lượng liên kết kcal.mol-1 của các dẫn xuất VK3 với 6 mục tiêu gắn kết Aβ40-
1BA4
Aβ42- 1Z0Q
WT-Aβ40 5Aβ17-42 12Aβ9-40 18Aβ9-40
VK3-1 -5.4 -4.6 -5.35 -5.3 -7.5 -7.1 VK3-2 -5.7 -5.3 -5.70 -5.4 -7.7 -6.2 VK3-3 -5.5 -4.9 -5.50 -6.0 -7.7 -6.1 VK3-4 -4.7 -5.2 -4.85 -6.3 -7.3 -5.8 VK3-5 -5.6 -5.6 -5.05 -7.1 -7.6 -6.4 VK3-6 -6.0 -5.6 -6.00 -5.6 -8.2 -6.6 VK3-8 -5.8 -4.9 -5.75 -5.6 -7.9 -6.5 VK3-9 -5.5 -5.5 -5.85 -6.2 -7.7 -6.5 VK3-10 -6.6 -6.0 -6.65 -7.0 -9.3 -8.0 VK-119 -5.6 -4.9 -5.65 -5.5 -7.1 -7.1 VK-221 -5.7 -4.8 -5.70 -5.5 -7.5 -7.6 VK-231 -5.4 -4.6 -5.35 -5.2 -6.8 -6.2 VK-232-2d -5.6 -4.6 -5.65 -5.8 -7.1 -6.6 VK-233 -5.2 -5.1 -5.25 -6.3 -7.0 -6.3 VK-224 -6.0 -5.8 -6.00 -6.2 -8.4 -7.1
Các dẫn xuất VK3 liên kết mạnh nhất với mục tiêu gắn kết 12Aβ9-40 trong 6 mục tiêu gắn kết. Vì mục tiêu này có cấu trúc sợi trưởng thành nhị xứng của β- amyloid 40, nên khả năng gắn kết lớn có nghĩa là khả năng phá hủy các đám rối Aβ40 lớn. Tiếp theo đó là khả năng phá hủy sợi trưởng thành β-amyloid 40 bậc 3 là 18Aβ9-40 cũng khá lớn.
3.2 So sánh về năng lƣợng liên kết giữa các dẫn xuất VK3.
So sánh năng lượng liên kết giữa các dẫn xuất VK3 với nhau chúng tôi nhận thấy VK3-10 có năng lượng liên kết với các mục tiêu gắn kết nhỏ nhất và ổn định nhất (xem bảng 3.1), từ kết quả này chúng tôi nhận xét rằng VK3-10 là dẫn xuất có khả năng phá hủy sự kết tập của các Aβ peptid mạnh nhất. Để đánh giá tác dụng phá hủy sự kết tập các Aβ peptid bởi các dẫn xuất VK3 chúng tôi tính trung bình năng lượng của 6 mục tiêu gắn kết ứng với mỗi dẫn xuất VK3 (bảng 3.2). Chúng ta có thể sắp xếp khả năng này như sau: VK3-10 > VK-224 > VK3-6 > VK3-5 > VK3-9 > VK3-8 > VK-221 > VK3-3 > VK3-2 > VK-233 > VK-119 > VK-232-2d > VK3-4 > VK-231 > VK3-1. Nên nhớ rằng kết quả này thu được bằng phương
pháp docking nên ứng dụng của nó bị hạn chế. Nhưng như ta sẽ thấy trong chương tiếp theo việc VK3-10 có khả năng cản trở quá trình tạo sợi tốt nhất phù hợp với thực nghiệm.
Bảng 3.2: Năng lượng liên kết trung bình kcal.mol-1 của các dẫn xuất VK3 với các mục tiêu gắn kết Aβ40-1BA4, Aβ42-1Z0Q, WT-Aβ40, 5Aβ17-42, 12Aβ9-40 và 18Aβ9-40.
VK3- 1 VK3- 2 VK3- 3 VK3- 4 VK3- 5 VK3- 6 VK3- 8 VK3- 9 VK3- 10 VK- 199 VK- 221 VK- 231 VK- 232-2d VK- 233 VK- 224 -5.88 -6.00 -5.95 -5.69 -6.23 -6.33 -6.08 -6.21 -7.26 -5.96 -6.13 -5.59 -5.89 -5.86 -6.58 3.3 Vùng gắn kết của các mục tiêu gắn kết
Trong hầu hết kết quả thu được, các túi liên kết của dẫn xuất VK3 với mục tiêu gắn kết Aβ40-1BA4, Aβ42-1Z0Q, 5Aβ17-42, 12Aβ9-40 và 18Aβ9-40 đều tập trung trong cùng một vùng không gian bên trong của mục tiêu gắn kết, vùng này chính là vùng gắn kết. Hầu như độ phân tán rất nhỏ, những hình ảnh tiêu biểu về vùng gắn kết của 5 mục tiêu gắn kết trên được thể hiện chi tiết trên hình 3.5 – 3.6 và 3.8 – 3.10 .
Trong khi đối với WT-Aβ40 vị trí túi gắn kết của các thụ thể rất khác nhau. Để thấy rõ điều này ta xét đại diện WT-Aβ40-5. Như hình 3.7 bên dưới, những dẫn xuất VK3 liên kết ở những vị trí khác nhau với thụ thể này nghĩa là WT-Aβ40- 5 không có vùng liên kết xác định. Vị trí của VK-233 thì rất khác với các vị trí của các dẫn xuất khác, trong khi VK-224 và VK3-232-2d lân cận gần nhất với các ASP-7, HIS-14, LYS-16, LEU-17, GLU-22, ASP-23, VAL-24, và SER-26. Ở đây lân cận gần có nghĩa là phối tử có liên kết nhánh phụ với mục tiêu gắn kết. Có hai vùng liên kết chính chứa 5 và 7 dẫn xuất VK3. VK3-10 được vây xung quanh bởi 6 acid amin TYR-10, GLU-11, VAL-12, PHE-20, VAL-36, và VAL-40; trong khi VK-233-2d có số lớn hơn các acid amin kề bên (11 acid amin). VK3-1, VK3-6, VK3-8, VK3-199 và VK3-221 có chỉ 5 acid amin lân cận. Dưới đây là liệt kê tất cả các acid amin của WT-Aβ40-5 có liên kết nhánh phụ với các dẫn xuất VK3 thể hiện trên hình 3.7: VK3-1: GLU11, LEU17, VAL18, PHE19, và PHE20;
VK3-3: GLU11, VAL12, HIS13, HIS14, GLN15, LYS16, PHE19, và PHE20;
VK3-4: TYR10, GLU11, VAL12, HIS13, HIS14, GLN15, LYS16, PHE19, và
PHE20;
VK3-5: TYR10, GLU11, VAL12, HIS13, GLN15, PHE20, VAL36, VAL39, và
VAL40;
VK3-6: SER8, TYR10, GLU11, VAL12, và HIS13;
VK3-8: GLU11, LEU17, VAL18, PHE19, PHE20, và ALA21; VK3-9: SER8, TYR10, GLU11, VAL12, HIS13, và VAL40; VK3-10: TYR10, GLU11, VAL12, PHE20, VAL36, và VAL40; 199: GLU11, LEU17, VAL18, PHE19, và PHE20;
221: TYR10, GLU11,VAL12, HIS13, và PHE20;
224: ASP7, HIS14, LYS16, LEU17, GLU22, ASP23, VAL24, và SER26; 231: GLU11, LYS16, LEU17, VAL18, PHE19, PHE20, và ALA21;
232: ASP7, HIS14, LYS16, LEU17, VAL18, GLU22, ASP23, VAL24, và
SER26;
233-2d: ASP1(N), ALA2, PHE4, TYR10, PHE20, ALA30, ILE31, ILE32, VAL36,
GLY38, vàVAL40
Hình 3.5: Vùng gắn kết Aβ40-1BA4, các dẫn xuất có độ phân tán rất nhỏ. Chỉ vẽ đại diện hai phối tử VK221 màu đỏ và VK3-1 màu xanh.
Vùng gắn kết
Vùng gắn kết
Vùng gắn kết
Hình 3.6: Tương tự như hình 3.5 nhưng cho mục tiêu gắn kết Aβ40-1Z0Q.
Hình 3.8: Vùng gắn kết 5Aβ17-42, các dẫn xuất tập trung tại vị trí biên, có độ phân tán nhỏ. Đỏ VK221, xanh VK3-1.
Hình 3.7: Vùng gắn kết WT-Aβ40-5, có 4 vị trí liên kết chính, các dẫn xuất VK3 chủ yếu tập trung tại 4 vị trí chính này.
3.4 Tƣơng quan về năng lƣợng liên kết của Curcumin và các dẫn xuất VK3
3.4.1 So sánh Curcumin và các dẫn xuất VK3
Sử dụng phương pháp docking thu được năng lượng liên kết của Curcumin vào 6 mục tiêu (bảng 3.3). Rõ ràng năng lượng liên kết của Curcumin với hai mục tiêu gắn kết 12Aβ9-40 và 18Aβ9-40 cũng nhỏ hơn các mục tiêu gắn kết còn lại giống như trường hợp của các dẫn xuất VK3. Điều này cho thấy sự biểu hiện tương đồng trong cách tương tác của Curcumin và các dẫn xuất VK3 với các mục tiêu gắn kết.