Đề tài sử phương pháp docking để thu được năng lương liên kết Ebind. Đại lương này cho phép giải thích khả năng gắn kết của của 15 dẫn xuất VK3 lên 10 mục tiêu gắn kết được liệt kê ở phần trên. Phần mềm Autodock Vina [96] được sử dụng để thu được kết các quả sau:
- Thu được cấu trúc 3D của hai phân tử VK3 và mục tiêu gắn kết. - Tìm được vùng gắn kết (binding site).
- Xác định được kiểu gắn kết. - Tính được năng lượng liên kết.
Từ công thức cấu tạo của dẫn xuất VK3, dùng phần mềm Gaussview thiết kế các phân tử 3D dẫn xuất VK3 tương ứng; kế tiếp lấy kết quả vừa có này cho chạy phần mềm Gaussian09W, cuối cùng thu được kết quả với sự tối ưu cấu trúc của những dẫn xuất VK3 (xem hình ảnh chi tiết từng chất trong bảng 1.1). Những dẫn xuất VK3 này sau đó được đem mô phỏng gắn kết với 10 mục tiêu được mô tả ở phần trên.
Để có thể gắn kết (dock) các phối tử vào các mục tiêu gắn kết, cần sử dụng AutodockTools 1.5.4 để tạo file PDBQT cho mục tiêu gắn kết và dẫn xuất VK3. Trường lực CHARMM được dùng để diễn tả tương tác nguyên tử. Phần mềm autodock vina sử dụng thuật toán Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno[89] dùng cho việc tối ưu hóa cực trị địa phương. Để thu được kết quả đáng tin cậy, việc chọn tham số chi tiết (exhaustiveness) bằng 400 là cần thiết, trong khi độ chênh lệch năng lượng lớn nhất giữa cấu hình liên kết tốt nhất và cấu hình liên kết tồi nhất được chọn là 7 kcal/mol. Dẫn xuất VK3 sẽ được xếp ngẫu nhiên ở vị trí ban đầu và các góc xoắn được tự do hoàn toàn. Hai mươi kiểu liên kết được sinh ra với vị trí ngẫu nhiên của dẫn xuất VK3 khi gắn vào mục tiêu gắn kết. Tâm của lưới (grid) mô phỏng được đặt tại tâm khối lượng của mục tiêu gắn kết, những kích thước của lưới mô phỏng là 60x40x40 Å và nó đủ lớn để bao trùm tất cả mục tiêu gắn kết.
Bảng 1.1: Cấu trúc 3D của các dẫn xuất VK3
STT Tên Gaussianview Gaussian09W
1 VK3-1
2 VK3-2
3 VK3-3
4 VK3-4
6 VK3-6 7 VK3-8 8 VK3-9 9 VK3-10 10 VK-119 11 VK-221
12 VK-231
13 VK-
232-2d
14 VK233
15 VK-224
Phải nhấn mạnh rằng độ chính xác của phương pháp docking không cao vì
bỏ qua thay đổi cấu hình của mục tiêu gắn kết và các cấu hình cho phép của phối tử cũng hữu hạn. Do vậy phương pháp này được dùng như cách lọc thô các phối tử tiềm năng từ các ngân hàng dữ liệu lớn. Tuy nhiên một ưu điểm lớn của phương pháp docking là nó cho phép tìm vị trí liên kết với độ tin cậy cao. Trong phần tiếp theo sẽ giới thiệu phương pháp tính năng lượng liên kết tự do chính xác hơn đó là phương pháp MM-PBSA.
1.7.2 Phương pháp mô phỏng động lực học phân tử
Phương pháp mô phỏng động lực học phân tử (MD) là một trong những công cụ cơ bản trong nghiên cứu lý thuyết của sinh học phân tử. Phương pháp này tính toán sự vận động phụ thuộc thời gian của hệ phân tử. Mô phỏng MD cung cấp thông tin chi tiết về những thay đổi cấu hình của protein và acid nucleic. Phương pháp MD thường được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc , động lực học và nhiệt động lực học của các phân tử sinh học và các tổ chức phức hợp của chúng.
1.7.2.1 Trường lực (force fileds)
Một trong những yếu tố mấu chốt quyết định độ chính xác của mô phỏng MD là trường lực hay thế năng tương tác giữa các nguyên tử. Hầu hết trường lực sử dụng trong mô phỏng sinh học phân tử được diễn tả bởi thế năng có dạng sau:
2 2 12 6 ( ) ( ) [1 cos( )] [ ] 2 ij ij i j n r ed eq n
bonds angles dehedrals i j ij ij ij
A B q q V V K r r K n R R R (1.1) Ở đây, ba tổng đầu tiên diễn tả những tương tác gần, trong đó req, và θeq là khoảng cách giữa các nguyên tử và góc liên kết ở trạng thái cân bằng. Năng lượng nhị diện được mô hình hóa bởi các hàm cosine của góc nhị diện . Tổng cuối cùng ứng với các tương tác xa van der Waals 6-12 và tương tác tĩnh điện được mô hình hóa bởi thế Coulomb với điện tích tập trung tại tâm của nguyên tử. Hiện nay người ta sử dụng các trường lực chính như AMBER[41], CHAARM[42], OPLS [6] và GROMOS [99]. Các hằng số tương tác và điện tích như Aij, Bij, qi v.v. phụ thuộc vào trường lực cụ thể. Trong luận văn này chúng tôi sử dụng trường lực hiệu dụng GROMOS96 43a1[14], được cập nhật trong phần mền GROMACS phiên bản 4.0.5 và mô hình nước SPC[14]
để chạy mô phỏng MD. Trường lực này đã được chứng minh là tốt trong nghiên cứu các chuỗi acid amin[62][63] và bài toán tính năng lượng liên kết [94].
1.7.2.2 Phương trình Langevin
Khi đã xác định được trường lực (2.1) ta có thể giải phương trình Langevin cổ điển để tìm ra trạng thái của hệ. Phương trình này có dạng sau:
2 2 c d r dr m F F dt dt . (1.2) γ là hệ số ma sát của môi trường, m là khối lượng của hạt và Fc = -dV/dr. Trong đó thế năng tương tác V được mô tả bởi phương trình (2.1). Do vậy (2.2) thực ra là phương trình Newton, nhưng người ta thêm vào lực ngẫu nhiên Γ để mô tả nhiệt độ của môi trường. Lực này được xem là thỏa mãn phổ của nhiễu trắng có trung bình
0
và hàm tương quan theo thời gian thỏa mãn:
( ) ( ')t t 2k TB (t t '). (1.3) Ở đây (t t ') là hàm delta-Dirac, hệ số ma sát chỉ ảnh hưởng đến tính chất động học chứ không ảnh hưởng đến tính chất nhiệt động lực học.
1.7.2.3 Thuật toán nhảy cóc (leap-frog)
Chúng ta có thể giải phương trình Langevin (2.2)-(2.3) bằng nhiều cách nhưng phương pháp MD được sử dụng trong GROMACS là thuật toán leap-frog[36]
nó thực hiện việc lấy tích phân phương trình chuyển động. Thuật toán leap-frog sử dụng tọa độr ở thời điểm t và vận tốc v ở thời gian t – 1/2∆t; nó cập nhật tọa độ và vận tốc bằng cách thông qua lực F(t) xác định bởi tọa độ ở thời điểm t:
( 1 ) ( 1 ) ( ) 2 2 t v t t v t t F t m (1.4) ( ) ( ) ( 1 ) 2 r t t r t tv t t (1.5)
Nó tạo ra quỹ đạo giống hệt thuật toán Verlet[52]: 1 2 4 ( ) 2 ( ) ( ) ( ) ( ) r t t r t r t t F t t t m (1.6)
Về tính hữu dụng của thuật toán và so sánh với các thuật toán khác có thể xem tài liệu tham khảo [13]. Lưu ý là những phương trình chuyển động thường được sửa đổi cho khớp với nhiệt độ và áp suất và được mở rộng để bao gồm sự cố định các liên kết.
1.7.2.4 Các thông số được sử dụng cho trường lực GROMOS
Trong phạm vi luận văn này chúng tôi sử dụng mô phỏng MD với trường lực GROMOS 96 43a1 có sẵn trong phần mền GROMACS[99]. Các thông số được chọn như sau. Các phương trình chuyển động được tích hợp bằng cách sử dụng thuật toán leap-frog (phương trình 2.4-2.6) [36] với bước nhảy thời gian ∆t = 2 fs. Thuật toán Lincs [37] được sử dụng để hạn chế chiều dài của tất cả các liên kết hóa học với một dung sai hình học tương đối bằng 10-4. Nhiệt độ coupling V-rescale được sử dụng để thay đổi vận tốc với thuật toán ngẫu nhiên[11], đã được sử dụng cho mỗi cặp nguyên tử để xác định nhiệt độ trong hệ với thời gian hồi phục là 0,1 ps. Áp suất được thiết lập bằng thuật toán Berendsen[12], được áp dụng để điều chỉnh áp suất, áp suất trong trường hợp này không đổi ở 1 atm. Lực van-der-waals (vdw) được tính toán với khoảng không tương tác (cutoff) 1,4nm. Phương pháp mạng lưới hạt Ewald (PME)[22] được sử dụng để mô tả tương tác điện tầm xa. Sự tương tác đối với các phần tử không liên kết cộng hóa trị với nhau được cập nhật mỗi 10fs với thiết lập khoảng không tương tác 1 nm.
1.7.2.5 Tính các giá trị trung bình trong mô phỏng MD
Phương pháp MD khi ta biết tọa độ và vận tốc của mỗi hạt tại thời điểm ban đầu, thì sau đó trạng thái của hệ có thể được dự đoán ở bất kỳ thời điểm nào. Để tính trung bình một đại lượng A nào đó ta dùng công thức tính trung bình theo thời gian:
1 0 1 1 lim ( ( ), ( )) ( , ) M N N N N time t t A A p t r t dt A p r M (1.7)
Trong đó τ là thời gian mô phỏng, M là số bước thời gian trong mô phỏng và ( N, N)
A p r là giá trị tức thời của A. Muốn có độ chính xác cao thời gian mô phỏng phải đủ lớn để hệ quét qua (hầu như) toàn bộ không gian pha. Trung bình theo thời gian (2.7) tương đương với trung bình theo hàm phân bố nếu điều kiện ergodic được đảm bảo.
1.7.3 Phương pháp MM-PBSA
Phương pháp này dựa trên mô phỏng động học phân tử. Năng lượng tự do liên kết ∆Gbind được định nghĩa như sau:
∆Gbind = Gcomplex – Gfree-protein – Gfree-ligand (1.8) Trong phương pháp tiếp cận MM-PBSA năng lượng tự do của mỗi phân tử được tính như sau:
G = Egas + Gsolvation – TS
Gsolvation = GPB + Gsur (1.9)
Gsur = γA + b.
Năng lượng tuyệt đối trong pha khí Egas được tính như sau:
Egas = Ebond + Eangle + Etors + Evdw + Eelec (1.10) Các đại lượng Ebond, Eangle và Etors theo thứ tự là năng lương liên kết cộng hóa trị, năng lương liên kết tương ứng với sự uốn, và tương tác torsion. Đại lượng Evdw
là tương tác van der Waals, Eelec tương tác tĩnh điện. Egas được tính trong GROMACS với trường lực GROMOS96 43a1, nhưng không sử dụng hạn chế cho
bán kính tương tác (cutoff). Điều này làm tăng độ chính xác khi đánh giá các tương tác không liên kết. Trong phương pháp MM-PBSA[44][87] năng lượng tự do (các phương trình 2.8-2.10) chứa đựng sự đóng góp từ các loại tương tác khác nhau.
Gsolvation đại diện cho năng lượng tự do hòa tan hóa (the free energy of solvation), còn TS là đóng góp của entropy. Gsolvation chứa hai phần, phần năng lượng tự do hòa tan hóa phân cực (GPB) và phần năng lượng tự do hòa tan hóa không phân cực (Gsur). GPB phát sinh từ thế tĩnh điện giữa chất tan và dung môi, và nó được xác định với sự giả định dung môi là liên tục[88]
. Phần mềm APBS được dùng để giải phương trình Poisson-Boltzmann tuyến tính bằng phương pháp giải số. Kích thước của mỗi ô lập phương trong lưới không gian là 0,5 Å. Hằng số điện môi được giả thiết là nằm trong khoảng ε = 78,54 (môi trường nước cất) đến ε = 2 (môi trường dung dịch chứa chất tan). Năng lượng bề mặt hay phần năng lượng tự do hòa tan hóa không phân cực Gsur được định nghĩa bởi diện tích bề mặt dung môi có thể tiếp cận (solvent-accessible) A và hai tham số kinh nghiệm (hiệu chỉnh) γ = 0,0072 kcal.mol-1.Å-2 và b = 0. Ở đây A được tính gần đúng bằng phương pháp số Shrake-Rupley[89] trong gói phần mềm APBS.
Các cấu hình thu được trong trạng thái cân bằng (cứ 10 ps ta giữ lại một cấu hình) sẽ dùng để ước tính enthalpy. Trong phương pháp gần đúng MM-PBSA những cấu hình thu được từ việc chạy MD cho hệ phức protein – phối tử được sử dụng để đánh giá Gfree-protein và Gfree-ligand.
Sự đóng góp của entropy chất tan được tính thông qua những cấu hình cuối cùng thu được từ việc chạy MD. Sử dụng liên hợp gradien và phương pháp bộ nhớ thấp (low-memory) Broyden-Fletcher-Goldfarb Shanno[99] cho tới khi lực cực đại nhỏ hơn 10-6 kJ.mol-1.nm-1thì ta thu được những cấu trúc cực tiểu hóa. Phân tích dao động riêng (normal mode) thực hiện bằng cách tính toán và chéo hóa ma trận khối lượng Hessian. Tần số dao động riêng, được sử dụng để tính toán entropy dao động [59]
0 0 0 / / 0 / ln(1 ) (1 ) B B B h k T h k T A vib h k T N e S R e T e (1.11)
Trong đó Sviblà entropy dao động, h là hằng số Planck, υ0 là tần số của dao động riêng, kB là hằng số Boltzmann, T = 300 K, và NA là số Avogadro.
1.7.4 Các phương pháp thực nghiệm
Tổng hợp và thanh lọc Aβ1-40: Aβ1-40 được tổng hợp bằng máy ABI 433A (máy tổng hợp peptid pha rắn)[97] sử dụng chuẩn giao thức FMOC (standard FMOC protocol - Fluorenylmethyloxycarbonyl) với chất dẻo nhân tạo HMP (HMP resin). Sau khi chia ra ống nhựa với hỗn hợp trifluoroacetic acid/H2O/ethanedithiol/thioanisole/phenol, các chuỗi peptide được chiết suất bằng dung dịch ether:H2O tỷ lệ 1:1 (v/v) chứa 0.1% 2- mercaptothanol. Aβpeptid vừa tổng hợp sẽ được tinh sạch bằng sắc ký cột đảo pha C18 với thang nồng độ từ 0% đến 78%. Độ tinh khiết của peptid thu được là trên 95% được xác định bởi phổ khối lượng MALDI–TOF. Một mg của A peptid tinh chế được hòa tan trong 0,23 ml với 100% TFE (Tetrafluoroethylene) tạo thành một hỗn hợp dung dịch mẹ và sau đó đem pha loãng để tạo thành hỗn peptid dùng trong thí nghiệm ứng với các điều kiện đã được thiết kế.
Mật độ những gốc tự do gây ra bởi Aβ1-40 được phân tích bằng cách sử dụng khảo sát dichlorofluoresein diacetat (DCFH-DA)[106]. Dichlorofluoresein diacetat được hòa tan trong hỗn hợp bao gồm: 100% thể tích dimethyl sulfoxid, deacetylated với 50% v/v và 0,05 M NaOH trong thời gian 30 phút. Sau đó được trung hòa (pH 7.5) và cô cạn sao cho đến nồng độ cuối cùng là 200 μM dung dịch mẹ. Dung dịch mẹ được đông lạnh và đặt trong bóng tối cho tới khi sử dụng. Phản ứng được thực hiện trong Dulbecco PBS với pH=7,5 trong một hệ thống đĩa 96 giếng với thể tích 200 μl/giếng chứa 25 μM Aβ40 và các nồng độ khác nhau của dẫn xuất VK3. Việc đọc huỳnh quang đã được ghi trên một đầu đọc microplate (FlexStation 3) với bước sóng kích thích 485nm và bước sóng bức xạ 530nm.
Thioflavin-T (ThT) được sử dụng để giám sát trạng thái kết tập của Aβ1-40. Aβ1-40 peptid từ 1mM peptid dung dịch mẹ trong DMSO được pha loãng trong 25mM phosphate đệm với pH=7,4. Tất cả các thí nghiệm đã được thực hiện trong nồng độ 25 μM Aβ40 peptid và 3 μM ThT ở nhiệt độ 37°C; các thí nghiệm thực hiện trong hai trường hợp không có dẫn xuất VK3 hoặc có từng dẫn xuất VK3 với 100 ng/ml dẫn xuất VK3. Việc đo huỳnh quang được thực hiện bằng một đầu đọc microplate (FlexStation 3) ở 37°C. Bước sóng kích thích 440 nm và bước sóng bức xạ 485 nm.
Khả năng tồn tại của tế bào được đo bằng cách sử dụng khảo sát tế bào WST-1[46] 1mM Aβ1-40 peptid được pha trong DMSO để làm dung dịch mẹ. Dung dịch mẹ mới pha được sấy khô bằng khí N2, và đưa lại vào trong chất đệm PBS pH=7, cho tới khi nồng độ peptide đạt 500 μM. Dung dịch thu được đem pha loãng cho đến 25 μM Aβ1-40 để đem khảo sát khả năng tồn tại. Trong một đĩa 96 giếng vi chuẩn, 5×104 tế bào được ủ với sự có mặt từng dẫn xuất VK3 hoặc không có dẫn xuất VK3 ứng với 25 μM A40 peptid trong tổng thể tích 200 μl trong mỗi buồng trong 24 giờ ở 37°C trong không khí ẩm với 5% CO2, trước khi đem khảo sát khả năng tồn tại của những tế bào. Dung dịch WST-1 (10 μl) được thêm vào trong mỗi buồng, và những buồng được ủ khoảng 4-5 giờ ở nhiệt độ phòng. Mật độ quang học (OD) được xác định tại bước sóng 450nm bằng cách sử dụng một đầu đọc microplate (FlexStation 3).
1.8 Phần mềm sử dụng
Phần mềm sử dụng: Autodock Vina phiên bản 1.1.2 [96], Pymol phiên bản 1.3[76], Autodock 4[77][78], Gaussview phiên bản 5.0.9[10], Gaussian09w phiên bản 7.0[29], Origin phiên bản 6.0[23], Gromacs phiên bản 4.5.4[40]. Ngoài phần mềm Autodock Vina còn nhiều phần mềm khác dùng để mô phỏng gắn kết phối tử vào mục tiêu gắn kết, ví dụ như phần mềm Autodock 4. Tuy nhiên phần mềm Autodock Vina có nhiều ưu điểm hơn phần mềm Autodock 4.[77][78] Do đó Autodock Vina
được chọn trong luận văn này. Để thực hiện mô phỏng MD chúng tôi sử dụng phần mềm GROMACS[99].
1.9 Các đại lƣợng dùng phân tích kết quả
1.9.1 Hệ số tương quan
Đây là một chỉ số thống kê đo lường tương quan giữa hai biến số. Hệ số