II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
5. Kỹ thuật kháng sinh đồ bằng phương pháp etest
Nguyên lý:
Cho phép xác định chính xác nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration – MIC) của kháng sinh của kháng sinh với chủng vi khuẩn hiếu khí dễ nuôi cấy.
Etest là băng plastic kích thước 5x57 mm được phân bổ dài MIC theoµgL và có mã code tên kháng sinh. Có 15 nồng độ kháng sinh được pha loãng bậc 2 gắn cố định mở một mặt của băng plastic. Khi băng Etest được đặt lên mặt thạch đã dàn vi khuẩn, kháng sinh ở có bậc nồng độ nhanh chóng khuếch tán trong thạch. Sau khi nuôi cấy qua đêm, sẽ xuất hiện vùng ức chế hình elip đối xứng qua băng plastic. Giá trị MIC được xác định trực tiếp tại điểm cắt của hình elip với băng Etest.
Lọc những bệnh nhân có sử dụng ciprofloxacin
Lọc những bệnh nhân nằm trong tiêu chuẩn lựa chọn
Xử lý thông tin và bàn luận kết quả
Thu thập thông tin theo mẫu phiếu thu thập bệnh án Lọc những bệnh nhân có kết quả cấy máu, dịch, đờm dương
tính với vi khuẩn
Vật liệu trang thiết bị:
Vật liệu:
- Thạch đĩa Muller-Hinton - Nước muối sinh lý vô trùng - Băng Etest
- Nuôi cấy trong khoảng từ 16-24h
- Chủng vi khuẩn cho kiểm tra chất lượng
Dụng cụ:
- Panh kẹp, kéo - Đèn cồn - Que cấy
- Que tăm bông vô trùng
Thiết bị:
- Máy lắc - Túi ấm - Máy ria
- Máy đo độ đục hoặc ống Mc Fanland 0.5
Quy trình:
Các bước chuẩn bị
- Chuẩn bị thạch: Chọn thạch thích hợp cho từng loài vi khuẩn (Muller- Hinton, Muller-Hintom máu…), đảm bảo chất lượng và độ dày (4.0+/0.5 mm).
- Chuẩn bị kháng sinh: Các hộp đựng kháng sinh phải được đặt ở nhiệt độ phòng (18-220C) trong 30 phút nếu giữ ở 40C hoặc 60 phút nếu lưu giữ ở -200C.
- Chuẩn bị canh khuẩn: Nhặt khuẩn lạc vi khuẩn hòa đều vào ống nước muối sinh lý vô trùng để có được dục tương đương với độ đục McFarland 0,5.
Các vi khuẩn khó nuôi cấy phải sử dụng ngay trong vòng 15 phút sau khi pha canh khuẩn.
Các bước tiến hành
- Dùng tăm bông vô trùng nhúng vào ống huyền dịch vi khuẩn đã pha ở trên, ép nhẹ và xoay tròn tăm bông trên thành bên của ông huyền dịch vi khuẩn để loại bớt phần huyền dịch vi khuẩn đã thấm vào đầu tăm bông. Sau đó, ria đều que tăm bông trên toàn bộ mặt đĩa thạch Mueller-Hinton. Xoay đều đĩa thạch theo góc 600 rồi ria đều que tăm bông.
Cứ tiếp tục xoay đĩa một góc 600 và ria que tăm bông để sao cho vi khuẩn được dàn đều lên trên toàn bộ mặt đĩa thạch. Cuối cùng, ria tăm bông vòng quanh bờ mép của mặt thạch. Đóng nắp đĩa thạch và để đĩa thạch sau ria cấy vài phút ở nhiệt độ phòng cho mặt thạch se lại. Có thể dùng máy ria vi khuẩn để dàn đều canh khuẩn lên mặt thạch.
- Để mặt thạch se lại hoàn toàn trước khi đặt băng Etest.
- Đặt băng Etest lên mặt thạch sao cho mặt có ghi dải nồng độ hướng lên trên và phải đảm bảo toàn bộ bề mặt của băng Etest được tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch.
- Khi đã đặt xong băng etest không được dịch chuyền băng Etest khỏi vị trí.
- Để các đĩa thạch vào tủ ấm thường hoặc tủ ấm CO2 nếu chủng vi khuẩn là H. influenzae, Streptococci, Neisseria.
Đọc kết quả
- Sau ủ ấm 16-24h và khi thấy rõ khuẩn mọc, đọc giá trị MIC ở thời điểm cắt hình elip với băng Etest. Không đọc kết quả khi bị lẫn 2 hay nhiều chủng vi khuẩn, khi vi khuẩn mọc quá dày hoặc quá thưa.
- Làm tròn giá trị MIC ở giữa hai bậc pha loãng lên giá trị cao hơn trước khi phiên giải kết quả.
- Phiên giải kết quả MIC ra phân loại S, I hoặc R theo tài liệu cua CLSI 2012.
- Với các kháng sinh diệt khuẩn, phải đọc giá trị MIC tại điểm vi khuẩn bị ức chế hòa toàn. Đặc biệt chú ý khi đọc với chủng pneumococci, streptococci, enterococci, Acinetobacter và Stenotrophomonas spp. Với các kháng sinh kìm khuẩn, phải đọc giá trị MIC tại điểm vi khuẩn bị ức chế 80%.
Kiểm tra chất lượng của qui trình kháng sinh đồ hàng tuần với các chủng chuẩn quốc tế ATCC sau:
+ Escherichia coli ATCC 25922
+ Staphylococcus aureus ATCC 29213 + Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853