III. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ
3. Các phương pháp xác định MIC: Có 2 phương pháp: Pha loãng và ETEST
3.3. Phương pháp xác định MIC pha loãng KS trong canh thang (Microwell)
* Nguyên lý và mục đích
Kỹ thuật này nhằm mục đích tìm biết chính xác nồng độ nhỏ nhất của kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của 1 chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy. Về mức độ chính xác, kỹ thuật này tinh vi hơn phương pháp kháng sinh đồ Kirby-Bauer. Vì vậy, kỹ thuật MIC chỉ thường dùng trong công việc chuẩn thức, để kiểm kiểm tra kết quả của phương pháp thông dụng Kirby-Bauer, hoặc dùng trong những trường hợp cần nghiên cứu chính xác.
Nguyên lý: cấy chủng vi khuẩn (từ bệnh phẩm) trên các đĩa môi trường có chứa nồng độ kháng sinh khác nhau; quan sát xem chủng vi khuẩn không phát triển được ở nồng độ nào, so sánh kết quả thử của các chủng mẫu quốc tế với những kết quả đã được biết trước để xác định tính chính xác cảu các kết quả thu được.
SINH VẬT PHẨM
Các loại kháng sinh và hóa dược:
Các thuốc thường dùng cho các vi khuẩn hô hấp: ampicillin, penicillin, G,V, tetracycilin, gentamicin, chloramphenicol, trimethoprim, sulfamethoxazole, erythromycin.
Các thuốc thường dùng cho các vi khuẩn đường ruột: ampicillin, tetracycilin, gentamicin, kanamycin, nalidixic acid, chloramphenicol, trimethoprim, sulfamethoxazole.
Cần biết hoạt lực của mỗi thứ kháng sinh, để có thể tính được nồng độ của dung dịch mẹ.
Dung dịch đệm dùng để pha các kháng sinh:
- Đệm phosphat 0.1M pH7, dùng cho ampicillin, tetracycilin, gentamicin, kanamycin, nalidixic acid, chloramphenicol, trimethoprim, sulfamethoxazole.
Chú ý: Chloramphenicol: cho một lượng methanol đủ để hòa tan kháng sinh, tiếp tục cho đệm phosphat vừa đủ thể tích.
Nalidixic acid, sulfamethoxazole: cho một lượng NaOH 1M đủ để hòa tan thuốc, tiếp tục cho đệm phosphat vừa đủ thể tích.
- Đệm phosphat 0.1M pH 8 dùng cho erythromycin - Nước cất dùng cho trimethoprim.
Các chủng loại vi khuẩn quốc tế:
Với tính nhạy cảm đã biết trước đối với từng loại kháng sinh, được dùng làm đối chứng mỗi lần thử.
- NCTC 8468 Hemophilus influenzae - 20/78 Staphylococcus aureus
- ATCC 25922 E.Coli
- Atcc 29212 Streptococcus faccalis
Các chủng mẫu để làm đối chứng cho phản ứng thử belactamaza: - ATCC 6538 Staphylococcus 209 (betalactamaza - dương) - NK 419/77 He mophilus influenzac (betalactamaza - dương) ATCC 25178 Dumas (kháng oxacillin)
Các môi trường:
- Mueller hinton (Oxoid hoặc BBL) - Blood agar base (BBL)
- Máu cừu đã loại fibrin, lấy máu và dùng ngay, có thể giữ ở tủ lạnh nhưng không được quá 2 ngày.
- NAD (nicotin adenin dinucleotit)
Các chủng vi khuẩn thử MIC là những chủng đã xác định và được giữ trong thạch mềm nếu là vi khuẩn đường ruột, các vi khuẩn hô hấp tốt nhất là được giữ ở dạng đông khô.
QUÁ TRÌNH TIẾN HÀNH
- Ngày 1: Nuôi cấy các chủng cần thử và các chủng mẫu quốc tế kiểm tra sự thuần khiết.
- Ngày 2: Kiểm tra các chủng nuôi cấy của ngày hôm trước. Xác định mật độ thích hợp của từng loại vi khuẩn để cấy. Mỗi lần dùng 2 chủng.
Ngày 3: cân kháng sinh. Cách tính:
Xg. Hoạt lực = Số lượng (ml). Nồng độ (mcg/ml)
Thí dụ: hoạt lực của chloramphenicol là 99,13%. Muốn pha 10ml chloramphenicol có nồng độ là 1600 mcg/ml thì ta tính như sau:
Xg = 10ml.1600mcg/ml.100 = 16140,421 mcg = 0.01614 g 99,13
Bảo quản các dung dịch đậm đặc trong lạnh – 250C. Một khi đã lấy ra, chỉ dùng trong phạm vi 1 ngày. Từ dung dịch đậm đặc này pha ra những đậm độ trung gian khác nhau theo bảng thí dụ kèm theo. Dự theo kết quả kháng sinh đo bằng phương pháp khuếch tán đĩa thấm kháng sinh (Kirby-Bauer) chúng ta có thể đưa ra những nồng độ thích hợp của từng loại kháng sinh cho từng loại vi khuẩn. Có thể dựa trên bảng kết quả tương ứng giữa giá trị MIC và phương pháp khuếch tán đĩa giấy thấm kháng sinh để đưa ra những nồng độ thích hợp. (bao gồm cả những chủng mẫu quốc tế).
Phương pháp pha các đậm độ kháng sinh Dung dịch mẹ 1280mcg/ml PBS Độ pha Đậm độ trung gian (mcg/ml) Đậm độ cuối cùng (mcg/ml) 1 2 3 4 5 2,5 ml + - - 1280 128 2ml + 2ml 1/2 640 64 1ml + 3ml 1/4 320 32 0,5ml + 3,5ml 1/8 160 16 1ml + 15ml 1/16 80 8 2ml 2ml 1/2 40 4 1ml 3ml 1/4 20 2 0,5ml+ 3,5 1/8 10 1 1ml + 15ml 1/16 5 0,5 2ml 2ml 1/2 2,5 0,25 1ml 3ml 1/4 1,25 0,125 0,5ml+ 3,5 1/8 0,64 0,064 1ml + 15ml 1/16 0,32 0,032 2ml 2ml 1/2 0,16 0,016 1ml 3ml 1/4 0,08 0,008
Đậm độ cuối cùng được tính theo tỷ lệ trộn 2,5ml dung dịch trung + 22,5ml thạch Mueller – Hinton (Pha loãng 1/10).
Đối với S.aureus, khi thử tính nhạy cảm của các chủng loại này với oxacillin: dùng một đĩa thạch máu cơ sở có 5% máu cừu với nồng độ oxacillin là 10mcg/ml. Cấy chủng mẫu kháng oxacillin (ATCC 25178 Dumas). Cấy toàn bộ chủng S.aureus, để tủ ấm 300C để từ 16-18 giờ. Đọc kết quả: chủng mẫu có mọc trên môi trường nếu có một chủng thử nào mọc được trên môi trường, có nghĩa là chủng có có kháng lại oxacillin.
Chú ý: trước khi tiến hành thử MIC, cần xác định các chủng sinh bealactamaza. Đối với các chủng này khi thử MIC, không cần thử với các kháng sinh betalactama.
Một lần tiến hành MIC, cần 2 đĩa thạch Mueller-Hinton đối chứng: Cho 2,5 ml PBS + 22,5 ml thạch Mueller – Hinton.
Các đĩa thạch đã pha kháng sinh được trong tủ lạnh 40C qua đêm. Trong điều kiện khí hậu ở Việt Nam, các đĩa thạch này không nên để quá 48 giờ.
Cấy tất cả các chủng cần thử MIC và các chủng mẫu quốc tê. Để vào tủ ấm 370C từ 16-18 giờ
Chú ý điều kiện khí trường theo yêu cầu cảu từng loại vi khuẩn: H.influenzae, S.pneumoniae, S.pyogenes để trong khí trường có 5% CO2
(trongđiều kiện không có tủ ấm CO2, tạo CO2 bằng cách cho các đĩa thạch vào một bình thủy tinh lớn, đốt nến, đậy nắp thật kín).
Ngày thư 4:
Các đĩa thạch phải được phơi khô trong tủ ấm 370C từ 20 – 30 phút. Xếp hai hàng ống nghiệm: một hàng ống nghiệm 16 mm có 3 ml PBS, dùng để pha hỗn dịch vi khuẩn tương đương với ống mẫu McFarland 0,5.
Một hàng ống nghiệm 12mm có 1ml PBS, dùng để pha loãng hỗn dịch vi khuẩn để có nồng độ tương đương với 5.10.
Dùng pipet Pasteur cho mỗi giếng khoảng 0,5 ml (mỗi chủng vi khuẩn cho vào một giếng) theo số chủng đã đáng dấu tren sơ đồ
101 112 120 131
135 143 145 146 148 150
151 154 157 158 161 152
165 166 170 212 118 219
230 231 233 235
Cấy bằng bộ phiên bản nhiều đầu
Cấy trên một đĩa thạch đối chứng, không có kháng sinh, để kiểm tra chủng loại khuẩn có thuần khiết hay đã bị nhiễm tạp khuẩn khác nhau trong quá trình tiến hành. Sau đó lần lượt cấy vi khuẩn vào từng loại kháng sinh (bắt đầu từ nồng độ nhỏ nhất)
Cuối cùng, cấy vào đĩa thạch đối chứng, không có kháng sinh, để kiểm tra trong quá trình cấy, các chủng vi khuẩn có bị chết hay bị nhiễm tạp khuẩn trong quá trình tiến hành.
Chú ý nhớ đánh dấu trên đĩa thạch, để khi đọc kết quả chúng ta biết được bát đầu từ vị trí nào của đĩa thạch.
Khi các nốt chấm vi khuẩn trên mặt thạch đã khô, lật úp mặt thạch, để vào tủ ấm 370C/16-18 giờ. Chú ý điều kiện khí trường: khi thử MIC, chỉ có S.pneumoniac và Branhamella catarrhalis cần khí trường CO2.
Ngày thứ 5: Đọc kết quả
Mỗi kháng sinh cần 1 tờ giấy để ghi kết quả theo mẫu sau đây: Kháng sinh Ampicillin
Môi trường: Mueller-Hinton Nhiệt độ và khí trường:
Trước hết phải đọc 2 đĩa chủng để kiểm tra các chủng vi khuẩn có thuần khiết và không bị chết trong quá trình tiến hành.
Đọc lần lượt từng loại kháng sinh, bắt đầu từ nồng độ thấp nhất. Đậm độ ức chế tối thiểu (MIC) là đậm độ kháng sinh nào có tác dụng ức chế sự phát triển có thể thấy được của vi khuẩn trên môi trường (=<50 cfu) (cfu: colony forming unit).
Ở nồng độ thấp nhất, không thấy vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là: nhỏ hơn hoặc bằng nồng độ đó. Trong trường hợp đến nồng độ cao nhất mà vẫn thấy vi khuẩn mọc thì kết quả ghi nhận là lớn hơn nồng độ đó.
Nhất thiết phải so sánh kết quả MIC của các chủng mẫu quốc tế với những kết quả đã dược biết trước. Sai số cho phép là một bậc nhỏ hơn hoặc một bậc lớn hơn. Nếu kết quả của các chủng mẫu quốc tế không chính xác thí nghiệm cần phải được làm lại.
Kháng sinh E.Coli MIC mcg/ml S.aureus MIC mcg/ml S.feacalis MIC mcg/ml H.influenzae MIC mcg/ml Ampicillin 4 0,125 1 0,25 Pen G Không thử 0,032 1 0,5 Pen V Không thử 0,032 1 4 Tetracyclin 2 0,25 8 0,5 Chloramphenicol 4 8 8 0,5 Erthromycin Không thử 0,5 2 2 Gentamycin 1 0,25 16 - Trim – Sulfa 1 1 1 4 Trimethoprim 0,25 0,5 0,5 -
NỒNG ĐỘ RANH GIỚI KHÁNG
Các chủng vi khuẩn có nồng độ tối thiểu ức chế lớn hơn nồng độ ranh giới kháng thì được coi là các chủng kháng lại kháng sinh đó.
Ampicillin > 16 mcg/ml Bensylpenicillin > 8 mcg/ml Fenoximetylpenicillin (PeV) > 4 mcg/ml Tetracyclin > 4 mcg/ml Kanamycin > 64 mcg/ml Gentamycin > 16 mcg/ml Nalidixic axit > 32 mcg/ml Chloramphennicol > 8 mcg/ml > 2 mcg/ml đối với H. influenzae Trimethoprim > 4 mcg/ml Trimethoprim – sulfamethoxazole > 32 mcg/ml Sulfisomidin > 265 mcg/ml