2.3.1. Thiết kế nghiờn cứu: phương phỏp nghiờn cứu mụ tả cắt ngang. 2.3.2. Cỡ mẫu và chọn mẫu nghiờn cứu 2.3.2. Cỡ mẫu và chọn mẫu nghiờn cứu
Bệnh glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt là bệnh di truyền hiếm gặp nờn lấy cỡ mẫu thuận tiện.
Qua thời gian tiến hành nghiờn cứu thu thập được:
86 bệnh nhõn được chẩn đoỏn mắc bệnh glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt tại bệnh viện Mắt Trung ương và xột nghiệm xỏc định đột biến gen CYP1B1. 29 thành viờn cú cựng huyết thống với bệnh nhõn mang đột biến gen CYP1B1 trong 15 gia đỡnh tham gia nghiờn cứu gồm 13 người bố, 13 người mẹ và 3 người em ruột của bệnh nhõn.
50 người khỏe mạnh để làm mẫu đối chứng.
2.3.3. Phương tiện nghiờn cứu
2.3.3.1. Dụng cụ, trang thiết bị
Dựng thăm khỏm mắt:
Bảng thị lực
Bộ đo nhón ỏp kế Maklakov sử dụng quả cõn 10g, mỏy đo nhón ỏp Icare Compa Amsler
Mỏy sinh hiển vi đốn khe
Kớnh soi gúc tiền phũng Goldmann một mặt gương
Mỏy soi đỏy mắt, mỏy thị trường, mỏy chụp OCT, mỏy Retcam Mỏy chụp ảnh
Dựng để xỏc định đột biến gen:
Ống lấy mỏu chống đụng EDTA Pipet, đầu cụn
Ống Eppendorf 1,5 ml và ống Facol
Mỏy Gene Amp PCR System 9700 (USA) Tủ lạnh sõu: -30°C; -80°C (SANYO) Mỏy điện di: Mupid (Nhật Bản)
Mỏy soi gel và chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA) Mỏy ly tõm lạnh Beckman (USA) và ly tõm để bàn Eppendorf (Đức) Lũ vi súng (Samsung)
Mỏy đọc trỡnh tự gen ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (USA) Tủ ấm
2.3.3.2. Hoỏ chất
Húa chất dựng để tỏch chiết DNA: dung dịch Lysis buffer, dung dịch
K, dung dịch SDS 10%, Proteinase K (10mg/mL), dung dịch phenol:chloroform:isoamyl với tỷ lệ 25:24:1, dung dịch chloroform:isoamyl với tỷ lệ 24:1, Ethanol 100% và ethanol 70%, Sodium acetate 3M, pH=5,2, dung dịch hũa tan DNA để bảo quản.
Hoỏ chất để thực hiện kỹ thuật PCR (Invitrogen): 10x buffer, dNTP
10 mM, Taq polymerase, cỏc cặp mồi (xuụi và ngược).
Hoỏ chất để điện di sản phẩm PCR trờn gel agarose: agarose, dung dịch
TBE 10X (Tris; acid boric; EDTA), Loading buffer 10X, Ethidium bromide.
Hoỏ chất để tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose (QIAGEN):
dung dịch QC, dung dịch Sodium acetat, dung dịch Isopropanol, dung dịch QG, cột QIA.
Hoỏ chất để đọc trỡnh tự gen: big dye, cột lọc, SAM và Terminator Solution.
Kit MLPA để xỏc định đột biến xúa đoạn và lặp đoạn: nghiờn cứu
này sử dụng kit MLPA (MRC- Holland). Kit gồm cỏc probe sử dụng trong chẩn đoỏn đột biến gen CYP1B1 gọi là P128-CYP450. Hỗn hợp probe này bao gồm cỏc probe đặc hiệu cho gen CYP1B1. Ngoài ra, cú 50 probe đặc trưng cho gen của người cũng được sử dụng trong hỗn hợp để làm đối chứng và 2 probe cho nhiễm sắc thể X và Y để xỏc định giới tớnh. Vị trớ và kớch thước của cỏc probe được mụ tả như bảng 2.1.
Bảng 2.1. Tờn, kớch thước và vị trớ của cỏc sản phẩm PCR trong Kit MLPA P128-CYP450 (MRC- Holland)
STT Tờn probe Vị trớ của probe trờn gen Kớch thước (base pair)
1 CYP1B1-1 Exon 1 136
2 CYP1B1-3 Exon 3 178
Trục hoành biểu hiện kớch thước sản phẩm PCR tăng dần theo chiều từ trỏi sang phải. Trục tung thể hiện nồng độ của cỏc sản phẩm phẩm PCR tỉ lệ thuận với chiều cao của cỏc đỉnh. Bệnh nhõn cú đột biến xúa đoạn đồng hợp tử khi khụng xuất hiện đỉnh tương ứng với exon bị xúa đoạn và đột biến xúa đoạn dị hợp tử khi chiều cao đỉnh bằng ẵ so với chiều cao đỉnh của mẫu đối chứng.
2.3.4. Cỏc bước tiến hành nghiờn cứu
2.3.4.1. Chẩn đoỏn bệnh nhõn và lập phả hệ gia đỡnh
Tất cả cỏc bệnh nhõn đều được hỏi, khỏm bệnh theo một mẫu bệnh ỏn thống nhất.
Hỏi bệnh: khai thỏc đầy đủ cỏc thụng tin họ tờn, tuổi, giới, địa chỉ, lý do đến
khỏm, tiền sử cỏ nhõn và gia đỡnh, thời gian phỏt hiện bệnh, cỏc phương phỏp điều trị trước đõy.
Khỏm bệnh:
Cỏc triệu chứng cơ năng: chúi, chảy nước mắt, sợ ỏnh sỏng, co quắp mi. Thử thị lực: trẻ lớn thử bằng bảng Landolt, trẻ bộ thử bảng hỡnh, nhận biết đồ vật, bảng Lea greating.
Đo nhón ỏp: đo bằng nhón ỏp kế Icare. Ở trẻ nhỏ cần đo nhón ỏp khi ngủ hoặc dưới gõy mờ.
Khỏm cỏc dấu hiệu lõm sàng:
- Mi mắt: cú xu hướng khộp lại nhằm hạn chế ỏnh sỏng vào mắt. - Kết mạc cú cương tụ, cú viờm khụng, cú sẹo mổ cũ.
- Vựng rỡa giỏc củng mạc cú gión lồi hay khụng.
- Giỏc mạc: đỏnh giỏ mức độ đục trong (trong hoàn toàn, đục nhẹ, đục trắng), đo đường kớnh ngang - dọc, vết rạn màng Descemet (vết Haab).
- Đỏnh giỏ độ sõu tiền phũng. Soi gúc tiền phũng bằng kớnh soi gúc Goldmann một mặt gương qua đú quan sỏt gúc tiền phũng rộng hay hẹp, tỡnh trạng bỏm của mống mắt, bất thường gúc.
- Đỏnh giỏ tỡnh trạng đồng tử, thể thủy tinh.
- Soi đỏy mắt đỏnh giỏ tỡnh trạng đĩa thị, tỷ lệ teo lừm đĩa, đỏnh giỏ tỡnh trạng mạch mỏu vừng mạc và dịch kớnh.
Dấu hiệu cận lõm sàng - siờu õm A: đo chiều dài trục nhón cầu.
Dấu hiệu toàn thõn: đối với glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt thường khụng cú cỏc dị tật bẩm sinh tại mắt và toàn thõn kốm theo.
Phõn loại giai đoạn bệnh (theo Al-Hazmi) [40]
Giai đoạn nhẹ: nhón ỏp <25mmHg, đường kớnh giỏc mạc <13mm, giỏc mạc cũn trong.
Giai đoạn trung bỡnh: nhón ỏp 25-35mmHg, đường kớnh giỏc mạc 13- 14mm, giỏc mạc phự đục.
Giai đoạn nặng: nhón ỏp >35mmHg, đường kớnh giỏc mạc >14mm, giỏc mạc đục trắng.
Lập phả hệ gia đỡnh
2.3.4.2. Quy trỡnh phõn tớch đột biến gen CYP1B1 trờn cỏc bệnh nhõn
Gia đỡnh bệnh nhõn được giải thớch về nghiờn cứu và kớ cam đoan tự nguyện tham gia nghiờn cứu.
Lấy khoảng 2ml mỏu ngoại vi chống đụng trong EDTA Tỏch chiết DNA từ mẫu mỏu của bệnh nhõn.
DNA được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch để thực hiện phản ứng PCR. Tiến hành giải trỡnh tự toàn bộ gen CYP1B1 phỏt hiện đột biến điểm, sử dụng cỏc cặp mồi được thiết kế bao phủ toàn bộ chiều dài gen CYP1B1 để tiến hành phản ứng PCR, sản phẩm PCR sẽ được giải trỡnh tự trực tiếp, so sỏnh với trỡnh tự GeneBank để phỏt hiện đột biến.
Tiến hành kỹ thuật MLPA xỏc định đột biến xúa đoạn: sử dụng Kit MLPA (MRC- Holland).
Xỏc định đột biến mới và khả năng gõy bệnh glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt của đột biến mới bằng phần mềm in silico (phần mềm Polyphen 2), khả năng gõy bệnh càng cao khi điểm đỏnh giỏ càng gần 1 điểm. Khẳng định đột biến mới khi giải trỡnh tự gen CYP1B1 của 50 người Việt Nam bỡnh thường khụng thấy xuất hiện đột biến giống như bệnh nhõn. Nếu cả 50 người khỏe mạnh khụng cú mang đột biến giống bệnh nhõn thỡ kết luận đõy là đột biến. Nếu cú bất kỳ trường hợp nào cú đột biến giống bệnh nhõn thỡ loại bỏ đột biến này mà xem xột như một đa hỡnh gen.
2.3.4.3. Quy trỡnh phỏt hiện người lành mang gen bệnh trờn cỏc thành viờn gia đỡnh cú quan hệ huyết thống với bệnh nhõn
Tỏch chiết DNA từ mẫu mỏu của người nhà bệnh nhõn.
Định vị cỏc vựng đột biến chỉ điểm và đột biến xúa đoạn (dựa vào kết quả phõn tớch gen CYP1B1 trờn bệnh nhõn của mỗi gia đỡnh) để phõn tớch đột biến.
Đề xuất tư vấn di truyền đối với cỏc thành viờn mang gen đột biến.
2.3.4.4. Quy trỡnh kỹ thuật nghiờn cứu
Quy trỡnh lấy mẫu
Bệnh nhõn và cỏc thành viờn gia đỡnh của bệnh nhõn, người đối chứng được lấy 2ml mỏu tĩnh mạch chống đụng bằng EDTA với hàm lượng 1,5mg/ml. Quy trỡnh đảm bảo tuyệt đối vụ trựng.
Quy trỡnh tỏch chiết DNA từ mỏu ngoại vi
DNA được tỏch chiết từ mỏu ngoại vi theo phương phỏp phenol/chloroform
Phương phỏp quang phổ
Dựa vào tỷ lệ OD260nm/OD280nm để kiểm tra độ tinh sạch của DNA. Nếu OD260nm/OD280nm = 1,8/2 thỡ DNA được coi là tinh sạch.
Kỹ thuật PCR để khuếch đại DNA
Toàn bộ 3 exon của gen CYP1B1 được khuếch đại với cỏc cặp mồi đặc hiệu [88]. Trỡnh tự cỏc cặp mồi được trỡnh bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Trỡnh tự mồi dựng cho phản ứng PCR
Mồi Trỡnh tự đoạn mồi (5’-3’) Kớch thước (bp)
1F-E1 5′-GAAAGCCTGCTGGTAGAGCTCC-3′
308
1R-E1 5′-CTGCAATCTGGGGACAACGCTG-3′
1F-E2 5’- TCT CCA GAG AGT CAG CTC CG-3’
449
1R-E2 5’-GGG TCG TGG CTG TAC-3’ TCG
2F-E2 5’-ATG GCT TTC GGA CAC TAC T-3’
787
2R-E2 5’-GAT CTT GGT TTT GAG GGG TG-3’
3F-E3 5’-TCC CAG AAA TAT TAA TTT AGT CAC TG-3’
885
3R-E3 5’-TAT GCA GCA CAC CTC ACC TG-3’
Thành phần của phản ứng PCR - thể tớch 20àl gồm: 100ng DNA, 5pmol primer, 200 àmol/l dNTP, 2 đơn vị enzym Taq polymerase và 2àl bufer II 20. Chu trỡnh nhiệt của phản ứng PCR: 94oC-7 phỳt, 35 chu kỳ [94oC–1phỳt, 55oC–1phỳt, 72oC–1phỳt], 72oC - 7phỳt.
Kỹ thuật giải trỡnh tự gen: tinh sạch sản phẩm PCR. Giải trỡnh tự gen theo
quy trỡnh, sử dụng phương phỏp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA).
Quy trỡnh thực hiện: tinh sạch sản phẩm PCR. Phõn tớch 0,1 thể tớch DNA
trờn gel agarose chứa 1àg/ml ethidium bromide. Trộn hỗn hợp trong ống Eppendof gồm: mastemix, Terminator ready Reaction Mix, primer và sản phẩm PCR. Mỗi phản ứng PCR sequencing sử dụng duy nhất một mồi. Chạy mẫu với chu trỡnh nhiệt tối ưu. Tinh chế sản phẩm bằng ABI phenol/ chloroform. Thu tủa DNA bằng ly tõm. Loại bỏ Ethanol. Để khụ. Sản phẩm được chạy trờn mỏy sequencer ABI. Trỡnh tự gen được đối chiếu và so sỏnh với trỡnh tự trờn GenBank (National center for biotechnology information,
NCBI) và phõn tớch theo phương phỏp ABI Prism 310 genetic analyzer (Applied Biosystems).
Kỹ thuật tiến hành phản ứng MLPA
+ Bước 1: Biến tớnh DNA
Cho 5ul dung dịch DNA (nồng độ 1020 ng/ml) cần phõn tớch vào ống PCR, biến tớnh ở 98°C trong 5 phỳt, chuyển về giữ ở 25°C.
+ Bước 2: Gắn (lai) probe vào gen đớch
Chuẩn bị hỗn hợp lai:
Thành phần Thể tớch
Dung dịch đệm MLPA 1,5 ml
Hỗn hợp probe 1,5 ml
Tổng số 3ml
Cho 3 ml hỗn hợp lai vào mẫu DNA đó biến tớnh, nõng nhiệt độ lờn 95°C trong 1 phỳt để biến tớnh probe, hạ nhiệt độ xuống 60°C, ủ qua đờm (1224h). Đõy là nhiệt độ để probe gắn đặc hiệu vào đoạn gen đớch.
+ Bước 3: Nối 2 đầu probe
Chuẩn bị dung dịch đệm gắn probe: cỏc dung dịch húa chất cần vortex nhẹ
cho đều trước khi pha dung dịch đệm. Thành phần gồm cú: dung dịch đệm A 3ml, dung dịch đệm B 3ml, nước 25ml và Enzym ligase 65 1ml.
Cho 32ml dung dịch đệm gắn probevào hỗn hợp lai ủ qua đờm ở trờn khi mẫu ở 54 C, tiếp tục chạy theo chu trỡnh nhiệt sau: 54 C/15phỳt→ 98 C/5phỳt→ 4 C/ . Sản phẩm lai này sẽ lưu trữ được 1 tuần/4 C, hoặc lõu hơn ở -20 C. + Bước 4: Khuếch đại sản phẩm lai (probe)
Dung dịch đệm phản ứng PCR: 4ml dung dịch đệm PCR, 26ml nước. Cho thờm vào hỗn hợp 10ml sản phẩm lai, đưa vào mỏy giữ ở 60 C.
Pha hỗn hợp phản ứng PCR gồm primer (cú gắn huỳnh quang) 2ml, dung dịch đệm 2ml, nước 5,5ml, Tag polymerase 0,5ml. Cho 10ml hỗn hợp phản ứng PCR này vào hỗn hợp đang trong mỏy giữ ở 60 C. Tiếp tục chu trỡnh nhiệt: (95 C/30 giõy, 600C/30 giõy, 720C/1 phỳt) x 35 chu kỳ, 720C/20 phỳt, giữ ở 40C.
Sản phẩm khuếch đại probe sẽ được điện di mao quản huỳnh quang trờn mỏy giải trỡnh tự gen để phõn tớch kết quả.
Sơ đồ nghiờn cứu
Chẩn đoỏn xỏc định bệnh nhõn glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt
Lấy mẫu mỏu bệnh nhõn (2ml) đựng trong ống chống đụng EDTA Giải thớch cho gia đỡnh và kớ cam đoan
chấp nhận tham gia nghiờn cứu Làm hồ sơ bệnh ỏn (đặc điểm lõm sàng, giai đoạn bệnh, điều trị)
Tỏch chiết DNA
Xỏc định đột biến bằng kỹ thuật giải trỡnh tự gen, MLPA
Cú đột biến Khụng cú đột biến
Lấy mẫu mỏu cỏc thành viờn gia đỡnh cú quan hệ huyết thống với bệnh nhõn
Phõn tớch mối liờn quan với lõm sàng Lập và phõn tớch phả hệ So sỏnh GenBank, phần mềm in silico, xỏc định trờn 50 mẫu đối chứng Xỏc định đột biến mới
2.3.4.5. Chỉ số, biến số nghiờn cứuvà tiờu chớ đỏnh giỏ kết quả
Chỉ số và biến số nghiờn cứu
Mục tiờu 1: Xỏc định đột biến gen CYP1B1 và mối liờn quan với lõm sàng trờn bệnh nhõn glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt.
Bệnh nhõn được đỏnh giỏ cỏc biến số và chỉ số về tiền sử bản thõn và gia đỡnh. Tuổi phỏt hiện bệnh được chia thành 3 giai đoạn ≤ 1 thỏng, 1-6 thỏng và > 6 thỏng. Giới, số mắt bị bệnh.
Đo chỉ số nhón ỏp, tớnh trung bỡnh và phõn thành 3 nhúm < 25mmHg, 25-35mmHg, >35mmHg.
Đỏnh giỏ mức độ trong suốt của giỏc mạc, chia 3 mức độ: trong, đục ớt, đục trắng. Đo đường kớnh giỏc mạc, tớnh trung bỡnh và chia 3 nhúm <13mm, 13-14mm, > 14mm.
Từ đú chia bệnh thành 3 giai đoạn nhẹ, trung bỡnh, nặng dựa theo phõn loại giai đoạn của Al-Hazmi.
Dựa trờn kết quả giải trỡnh tự gen CYP1B1, so sỏnh với trỡnh tự trờn GenBank và kết quả giải trỡnh tự gen của nhúm chứng, xỏc định được số lượng, vị trớ, loại đột biến ở bệnh nhõn glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt đồng thời phỏt hiện đột biến mới.
Đỏnh giỏ mối liờn quan giữa đột biến xỏc định được với cỏc đặc điểm lõm sàng như thời gian khởi phỏt bệnh, giai đoạn bệnh, triệu chứng và cỏc dấu hiệu, kết quả đỏp ứng với điều trị.
Mục tiờu 2: Phỏt hiện người lành mang gen bệnh trờn cỏc thành viờn gia đỡnh
cú quan hệ huyết thống với bệnh nhõn glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt.
Lựa chọn cỏc thành viờn gia đỡnh cú quan hệ huyết thống với bệnh nhõn mang đột biến gen. Lấy mỏu xột nghiệm để phỏt hiện người lành mang gen bệnh trờn cỏc thành viờn gia đỡnh cú quan hệ huyết thống với bệnh nhõn dựa trờn kết quả giải trỡnh tự gen CYP1B1.
Phả hệ di truyền là phả hệ cú bố và/ hoặc mẹ bệnh nhõn mang đột biến gen CYP1B1 đột biến di truyền cho con.
Phả hệ khụng di truyền là phả hệ cú bố và mẹ khụng mang đột biến gen CYP1B1 mà đột biến phỏt sinh trong quỏ trỡnh tạo giao tử.
2.3.4.6. Xử lý kết quả
Cỏc số liệu được ghi chộp vào bệnh ỏn nghiờn cứu và xử lý theo thuật toỏn thống kờ y học với phần mềm SPSS 16.0. So sỏnh cỏc biến định lượng bằng T-test, so sỏnh cỏc biến định tớnh bằng Test 2. Mối liờn quan giữa cỏc yếu tố với tỡnh trạng đột biến được đỏnh giỏ thụng qua giỏ trị OR (tỉ suất chờnh) và khoảng tin cậy 95% của OR. Giỏ trị p < 0,05 được coi là cú ý nghĩa thống kờ khi sử dụng để kiểm định sự khỏc biệt về kết quả.
2.4. Vấn đề đạo đức trong nghiờn cứu
Đề tài tuõn thủ chặt chẽ theo đạo đức nghiờn cứu trong Y học. Bệnh nhõn và gia đỡnh hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiờn cứu, cú sự chấp thuận của đại diện bệnh nhõn và/hoặc gia đỡnh bệnh nhõn.
Cỏc gia đỡnh bệnh nhõn cú thể rỳt khỏi nghiờn cứu khi khụng muốn tham gia. Đại diện gia đỡnh bệnh nhõn được thụng bỏo về kết quả xột nghiệm, đồng thời giải thớch về khả năng điều trị và phũng bệnh.
Cỏc thụng tin của bệnh nhõn và gia đỡnh sẽ được đảm bảo bớ mật (cỏc thụng tin về bệnh nhõn, bao gồm cả phần hỏi bệnh, khỏm bệnh và kết quả xột nghiệm chỉ được nhúm nghiờn cứu tiết lộ cho bệnh nhõn và người đại diện gia đỡnh của bệnh nhõn).
Nghiờn cứu được tiến hành hoàn toàn vỡ mục đớch khoa học, lợi ớch của bệnh nhõn và gia đỡnh bệnh nhõn.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU 3.1. Đặc điểm bệnh nhõn glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt
3.1.1. Phõn bố bệnh nhõn theo tuổi phỏt hiện bệnh
Tuổi phỏt hiện bệnh là thời gian tớnh từ khi bệnh nhõn được sinh ra đến khi gia đỡnh phỏt hiện dấu hiệu bất thường đầu tiờn tại mắt của trẻ.
Bảng 3.1. Tuổi phỏt hiện bệnh
Tuổi phỏt hiện bệnh Số bệnh nhõn Tỷ lệ (%)
ngay khi sinh - 1 thỏng tuổi 50 58,2