Đến năm 2017, Chouiter và cộng sự đó tiếp tục tổng kết thấy cú 20 loại đột biến được tỡm thấy, trong đú 47,1% đột biến nằm trờn exon 2 và 52,9% đột biến nằm trờn exon 3 [41] (Phụ lục 3).
Bờn cạnh đú, cỏc loại đột biến gen xảy ra ở cỏc chủng tộc trờn thế giới là khỏc nhau [42]:
Người chõu Á: phỏt hiện 64 bệnh nhõn với 120 đột biến gen CYP1B1.
Ba vị trớ đột biến hay gặp nhất là p.V364M, p.L385F và p.R390H. Đột biến p.V364M được tỡm thấy trong 15 trường hợp (15 trong số 120 đột biến, 12,50%), p.L385F đột biến trong 14 trường hợp (11,67%), p.R390H đột biến trong 10 trường hợp (8,33%).
Người da trắng: phỏt hiện 252 bệnh nhõn da trắng với 522 đột biến gen. 9 đột biến phổ biến nhất là: p.R368H, p.8037dup10, p.R390H, 7901del13, 4340delG, p.G61E, p.E387K, p.E229K và p.R390C/S. Tỷ lệ cỏc loại đột biến phõn bố như sau: p.R368H được tỡm thấy trong 61 trường hợp (61 trong số 522, 11,69%), p.8037dup 10 trong 35 trường hợp (6,70%), p.R390H đột biến trong 29 trường hợp (5,56%), p.7901del 13 đột biến trong 27 trường hợp (5,17%), p.4340delG trong 26 trường hợp (4,98%), p.G61E trong 24 trường hợp (4,60%), p.E387K trong 22 trường hợp (4,21%), p.E229K trong 21 trường hợp (4,02%), p.R390C/S trong 20 trường hợp (3,83%).
Hỡnh 1.11. Loại và vị trớ đột biến gen CYP1B1 thường gặp ở người da trắng Người Di-gan: cỏc nghiờn cứu phỏt hiện được 27 bệnh nhõn với 54 đột
biến gen CYP1B1, trong đú đột biến hay gặp nhất là p.E387K, chiếm79,63% (43 trường hợp).
Hỡnh 1.12. Loại và vị trớ đột biến gen CYP1B1 thường gặp ở người Di-gan Người Trung Đụng: phỏt hiện 402 đột biến ở 199 bệnh nhõn. Trong đú
phổ biến nhất là đột biến p.G61E chiếm 45,52% (183 trong số 402 đột biến). Cỏc đột biến hay gặp khỏc là 8006G>A p.R390H (8,71%), p.R469W) (8,21%) và 4339delG (5,72%).
Hỡnh 1.13. Loại và vị trớ đột biến gen CYP1B1 gặp ở người Trung Đụng 1.2.2. Cỏc kỹ thuật phỏt hiện đột biến gen CYP1B1
1.2.2.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Nguyờn tắc chung
Dựa vào hoạt tớnh của cỏc DNA polymerase xỳc tỏc tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuụn, với nguyờn liệu là bốn loại nucleotid. Phản
ứng này đũi hỏi sự cú mặt của những mồi xuụi và mồi ngược cú trỡnh tự bổ sung với hai đầu của trỡnh tự DNA khuụn.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước: biến tớnh, bắt cặp, kộo dài chuỗi.
Cỏc thành phần tham gia phản ứng PCR: gồm cú DNA khuụn, mồi, cỏc nucleotid tự do, enzym DNA polymerase và dung dịch đệm của phản ứng [44], [45], [46], [47].
PCR đơn mồi (monoplex PCR): là PCR kinh điển nhất, trong mỗi phản ứng
PCR, chỉ sử dụng duy nhất một cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại một đoạn gen đặc hiệu từ phõn tử DNA của tế bào [48].
Cỏc tỏc giả đó sử dụng từng cặp mồi để khuếch đại từng exon của gen
CYP1B1 bằng phản ứng PCR, sau đú điện di trờn gel agarose, mẫu bệnh nhõn
được tiến hành song song với mẫu đối chứng. Nếu mẫu đối chứng xuất hiện vạch DNA tương ứng với kớch thước của exon được khuếch đại, trong khi mẫu bệnh nhõn khụng xuất hiện vạch thỡ bệnh nhõn bị đột biến mất đoạn exon đú.
Để khuếch đại gen CYP1B1 trong bệnh glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt, cỏc nghiờn cứu trước đõy đều sử dụng phương phỏp PCR.
Hỡnh 1.14. PCR khuếch đại exon 2, gen CYP1B1 đột biến p.G61E [36]
1.2.2.2. Kỹ thuật giải trỡnh tự gen (DNA sequencing)
Giải trỡnh tự gen (DNA sequencing) là phương phỏp xỏc định vị trớ sắp xếp của cỏc nuceotid trong phõn tử DNA. Ngày nay kỹ thuật giải trỡnh tự gen được ứng dụng rộng rói để phỏt hiện cỏc đột biến gen gõy bệnh tại mắt và
toàn thõn như bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh, bệnh Wilson, viờm thị thần kinh Leber, ung thư vừng mạc, bệnh thoỏi húa sắc tố vừng mạc. Hiện nay, người ta thường sử dụng hai phương phỏp giải trỡnh tự đú là phương phỏp dideoxynucleotid và giải trỡnh tự bằng mỏy tự động.
Giải trỡnh tự theo phương phỏp dideoxynucleotid
Phương phỏp này do Sanger và cộng sự phỏt hiện ra năm 1977. Nguyờn lý của phương phỏp này như sau: dideoxynucleotid (ddNTP) là một phõn tử nhõn tạo, cấu trỳc của nú tương tự như phõn tử deoxynucleotid (dNTP), tuy nhiờn ở carbon số 3 của đường deoxyribose khụng phải là nhúm hydroxyl (– OH) mà là – H (hỡnh 1.16).
Deoxynucleotid
triphosphat Dideoxynucleotidtriphosphat
(A)
Deoxynucleotid
triphosphat Dideoxynucleotidtriphosphat Deoxynucleotid
triphosphat Dideoxynucleotidtriphosphat
(A)