CHƯƠNG 4 : BÀN LUẬN
4.2.1. Tỡnh trạng đột biến gen CYP1B1
4.2.1.1. Tỷ lệ đột biến gen CYP1B1
Chỳng tụi tiến hành nghiờn cứu xỏc định đột biến gen cho 86 bệnh nhõn bằng phương phỏp giải trỡnh tự toàn bộ gen CYP1B1 để phỏt hiện đột biến điểm và MLPA để phỏt hiện đột biến xúa đoạn thấy tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 là 22,1%. Kết quả phự hợp với cỏc nghiờncứu trước đõy cho thấy đột biến gen này ở chõu Á là khoảng 20%, tuy nhiờn cú khỏc biệt so với cỏc vựng lónh thổ khỏc nhau trờn thế giới.
Theo tổng kết của Chouiter L. năm 2017, trờn thế giới từ năm 2011 đến năm 2016 cú 19 nghiờn cứu về đột biến gen CYP1B1 được thực hiện với tổng số 1220 bệnh nhõn kết luận tỷ lệ phỏt hiện đột biến gen CYP1B1 trung bỡnh là 41,6%. Trong đú, đột biến gen CYP1B1 hay gặp nhất ở Trung Đụng (64,8%) và Địa Trung Hải (54,4%) do tỡnh trạng kết hụn cận huyết gõy nờn, tiếp đến là chõu Âu (34,7%), chõu Á (21,3%), tỷ lệ thấp nhất ở Mỹ (14,9%) [41].
Tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 trong nghiờn cứu của chỳng tụi thấp hơn nhiều so với vựng Trung Đụng và Địa Trung Hải. Theo nghiờn cứu tại Ả rập Saudi của Osama M. Badeeb (2014) tiến hành trờn 34 bệnh nhõn thấy tỷ lệ đột biến là 27/34 bệnh nhõn (79,4%). Qua đỏnh giỏ đặc điểm bệnh nhõn thấy tỷ lệ đột biến rất cao do tỡnh trạng kết hụn cận huyết gõy nờn, tỷ lệ này ở
nhúm kết hụn cận huyết là 21/23 bệnh nhõn (91%) và nhúm khụng cú kết hụn cận huyết là 6/11 bệnh nhõn (54,5%) [68]. Cũng trong năm này, một nghiờn cứu khỏc của Bouyacoub Y. trờn 18 bệnh nhõn ở Tunisia cho thấy tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 là 55% [69]. Nghiờn cứu tại Marroc (2010) ở 90 bệnh nhõn thấy tỷ lệ đột biến là 47,77% (43/90 bệnh nhõn) [62]. Trong nghiờn cứu này chỳng tụi khụng cú trường hợp nào kết hụn cận huyết, đõy cũng phự hợp với phong tục tập quỏn của Việt Nam nờn tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 khụng cao.
Ở chõu Âu, tỷ lệ đột biến gen trong nghiờn cứu của Sitorus năm 2003 ở 9 bệnh nhõn thuộc cỏc nước Đức, í, Hungari, Anh và Thổ Nhĩ Kỳ là 22,2% [70]. Tại Phỏp, Colomb E. đó chỉ ra rằng tỷ lệ đột biến gen này là 48% (15/31 bệnh nhõn) [71]. Nghiờn cứu của Campos-Mollo E. ở Tõy Ban Nha (2009) cũng cho thấy tỷ lệ tương tự 34% trong số 38 bệnh nhõn glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt [65].
Ở chõu Á, tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 là khoảng 20%. Nghiờn cứu của Yukihiko Mashima tại Nhật Bản (2001) tiến hành trờn 65 bệnh nhõn glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt thấy tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 là 13/65 bệnh nhõn (20%) [72]. Tỷ lệ này ở nghiờn cứu trờn 12 bệnh nhõn Indonesia cao hơn là 33,3% [70]. Năm 2011, nghiờn cứu tại Hàn Quốc đó phỏt hiện 22 bệnh nhõn mang đột biến gen CYP1B1 trong số 85 bệnh nhõn chẩn đoỏn bệnh glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt chiếm tỷ lệ 25,9% [24]. Cựng năm này, nghiờn cứu trờn 54 bệnh nhõn ở Ả rập phỏt hiện 41 trường hợp đột biến gen CYP1B1 (75,9%) [73]. Trong nghiờn cứu tại Nam Triều Tiờn (2012) đó phỏt hiện 63/85 trường hợp mang đột biến gen (74,1%) [74]. Nghiờn cứu mới đõy tại Trung Quốc (2014) ở 238 bệnh nhõn cho thấy tỷ lệ đột biến gen là 17,2%, trong đú cú 9 đột biến mới [64].
Kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi cũng như nghiờn cứu của Đỗ Tấn năm 2016 ở 30 bệnh nhõn Việt Nam là 16,7% [61].
Bảng 4.1. Kết quả phỏt hiện tỷ lệ đột biến ở bệnh nhõn chõu Á
Nghiờn cứu Chen X.
(2014) Sitorus R. (2003) Mashima Y. (2001) Đỗ Tấn (2016)
Nghiờn cứu này (2018)
N n=192 n=12 n=65 n=30 n=86
Quốc gia Trung Quốc Indonesia Nhật Bản Việt Nam Việt Nam
Tỷ lệ phỏt hiện đột biến 21/192 (17,2%) 4/12 (33,3%) 13/65 (20%) 5/30 (16,7%) 19/86 (22,1%)
4.2.1.2. Vị trớ đột biến trờn gen CYP1B1
Theo thống kờ của Li, đột biến gen CYP1B1 trờn bệnh nhõn glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt chủ yếu là đột biến điểm trờn exon 2 và exon 3 [75].
Trong nghiờn cứu của chỳng tụi, đột biến chủ yếu được phỏt hiện trờn exon 2 với 11/12 đột biến (91,7%) và chỉ cú 1 đột biến trờn exon 3 (chiếm 8,3%). Kết quả này cũng tương tự nghiờn cứu của Đỗ Tấn trờn 30 bệnh nhõn glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt Việt Nam phỏt hiện 5 đột biến điểm đều nằm trờn exon 2 (p.H279L, p.L283F, p.L107V, p.V320L và p.A121_S122insDRPAFA) [76]. Từ đú cú thể nhận định rằng đột biến điểm trờn gen CYP1B1 ở bệnh nhõn Việt Nam xảy ra chủ yếu trờn exon 2.
Bờn cạnh đú, nghiờn cứu phỏt hiện 2/86 trường hợp cú đột biến xúa đoạn bằng kỹ thuật MLPA. Với Kit mồi cho exon 1-exon 3, thấy cả hai bệnh nhõn cú xúa đoạn toàn bộ gen này. Tỷ lệ đột biến xúa đoạn chỉ phỏt hiện được tỷ lệ đột biến là 2,3%, do đú kỹ thuật giải trỡnh tự vẫn là kỹ thuật ưu tiờn để xỏc định cỏc đột biến gen CYP1B1 trờn bệnh nhõn.Tuy nhiờn nếu khụng khuếch đại được exon trờn gen CYP1B1 thỡ bệnh nhõn nờn được phõn tớch bằng MLPA.
Theo tổng kết năm 2010, trong 52 nghiờn cứu được bỏo cỏo đó phỏt hiện 542 bệnh nhõn mang 147 đột biến khỏc nhau trờn gen CYP1B1. Trong số 1007 đột biến phỏt hiện được cú 2 đột biến ở vựng khụng mó húa thuộc exon 1; 489 đột biến phỏt hiện được ở exon 2 và 516 đột biến phỏt hiện được ở exon 3 [75]. Trong nghiờn cứu này, bằng phương phỏp giải trỡnh tự gen chỳng tụikhụng phõn tớch đột biến điểm nằm trong vựng khụng mó húa gen CYP1B1.
Theo tổng kết của Chouiter L. năm 2017, trờn thế giới từ năm 2011 đến năm 2016 cú 19 nghiờn cứu về đột biến gen CYP1B1 được thực hiện với tổng số 1220 bệnh nhõn phỏt hiện 99 đột biến trong đú 47,1% đột biến trờn exon 2 và 52,9% đột biến trờn exon 3 [77].
Trong nghiờn cứu của Chen X. trờn 192 bệnh nhõn glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt Trung Quốc cũng phỏt hiện 18 đột biến và trong đú 11/18 đột biến trờn exon 2 và 7/18 đột biến trờn exon 3 [78].
4.2.1.3. Cỏc loại đột biến gen CYP1B1
Nghiờn cứu này sử dụng kĩ thuật giải trỡnh tự đó phỏt hiện 17/86 trường hợp cú đột biến gen CYP1B1, trong đú cú 9 đột biến mới, 3 đột biến sai nghĩa và 3 đa hỡnh nucleotid đó cụng bố trước đõy. Ngồi ra chỳng tụi phỏt hiện thờm 2/86 trường hợp cú đột biến xúa đoạn bằng kỹ thuật MLPA.
Theo hai nghiờn cứu thống kờ về tỡnh hỡnh nghiờn cứu đột biến gen CYP1B1 của Li từ trước năm 2010 và Chouiter L. đến năm 2017, cú 6 dạng đột biến hay gặp trờn gen CYP1B1. Nghiờn cứu của chỳng tụi phỏt hiện được 4 dạng đột biến, hay gặp nhất vẫn là dạng đột biến sai nghĩa (missense) 17,7% so với 66,8%, tiếp đến là đột biến vụ nghĩa (nonsense) chiếm 3,5% so với 3,55%, đột biến xúa đoạn (deletion) chiếm 2,4% so với 14,12%, đột biến lệch khung dịch mó (frameshift) chỉ gặp ở 1 bệnh nhõn chiếm tỷ lệ 1,2%.
Chỳng tụi khụng phỏt hiện trường hợp nào cú đột biến lặp đoạn (duplication) và đột biến thờm/mất nucleotid (deletion/insertion).
Trong nghiờn cứu này, 12 đột biến điểm gen CYP1B1 được phỏt hiện bằng kỹ thuật giải trỡnh tự. Trong đú, 10/12đột biến sai nghĩa (83,3%), 2/12 đột biến vụ nghĩa và 1/12 đột biến xúa nucleotid. Kết quả này cũng tương đồng với cỏc tỏc giả trờn thế giới.
Theo cỏc nghiờn cứu tại Úc tỷ lệ đột biến sai nghĩa là khoảng 72,7% tổng số đột biến phỏt hiện được. Theo những nghiờn cứu ở chõu Á, tỷ lệ đột biến loại này dao động khoảng từ 60% đến 97% trong tổng số đột biến gen CYP1B1 cụ thể ở Nhật là 66,8%; Indonesia là 62,5%; Ả rập là 96,5% và Iran là 90%.
Bằng kỹ thuật MLPA, chỳng tụi phỏt hiện 2/85 truờng hợp cú đột biến xúa đoạn. Cỏc nghiờn cứu trờn thế giới cũng chỉ ra một số cỏc dạng đột biến khỏc cũng được tỡm thấy nhưng tỷ lệ rất thấp như đột biến xúa đoạn, lặp đoạn, đột biến vụ nghĩa hay thờm nucleotide [75]. Trong nghiờn cứu của Đỗ Tấn trờn bệnh nhõn Việt Nam cú 4 đột biến sai nghĩa (4/5 đột biến) và 1 trường hợp là đột biến thờm đoạn (1/5 đột biến) [61]. Nghiờn cứu của Chen X. trờn bệnh nhõn Trung Quốc phỏt hiện 19 đột biến trong đú 16/19 đột biến sai nghĩa (chiếm 84,2%), 2/19 đột biến vụ nghĩa tạo mó kết thỳc sớm và 1/19 đột biến dịch khung [27].
Nghiờn cứu của chỳng tụi đó phỏt hiện đột biến p.E229K chiếm tỷ lệ cao nhất với 7/86 trường hợp và đột biến mới phổ biến nhất là p.Q86K với 4/86 trường hợp.
Theo tổng kết của Li, 3 đột biến phổ biến ở người chõu Á là p.Val364Met, p.Arg390His và p.Leu385Phe [75]. Theo tổng kết của Chouiter L. năm 2017, đột biến p.Val320Leu dường như chỉ xuất hiện ở Việt Nam, tuy
nhiờn trong nghiờn cứu này chỳng tụi khụng tỡm thấy cỏc đột biến trờn [77]. Phõn tớch in silico sử dụng phần mềm dự đoỏn kiểu hỡnh protein,
chỳng tụi thấy đột biến p.L27Q, p.Q86K, p.D218H, p.D242N, p.G365E được dự đoỏn cú khả năng gõy bệnh (điểm 0,992-1,000). Ngoài ra cỏc đột biến mới p.L191Sfs*4 gõy dịch khung dịch mó và 2 đột biến p.Q159X, p.Q164X tạo mó kết thỳc sớm cũng là cỏc đột biến gõy bệnh.So sỏnh hệ gen giữa cỏc loài cho thấy cỏc vị trớ 27, 86, 218, 242 và 365 đều cú độ bảo toàn cao. Tuy nhiờn muốn khẳng định cỏc đột biến trờn là đột biến gõy bệnh cần phải cú nghiờn cứu in vitro hoặc trờn mụ hỡnh động vật.
Bờn cạnh đú, chỳng tụi cũng tỡm thấy 3 đột biến sai nghĩa đó được cụng bố trước đõy là p.G61E, p.V198I và p.E229K.
Đột biến p.V198I cũng được tỡm thấy trờn bệnh nhõn Nhật Bản, trong khi đột biến p.E229K được tỡm thấy trờn bệnh nhõn Iran và gợi ý gõy ra kiểu hỡnh nặng [79], [80].
Ngoài ra, nghiờn cứu của chỳng tụi cũng tỡm được 3dạng đa hỡnh thỏi đó được cụng bố trước đõy là p.R48G, p.A119S trờn exon 2 và p.L432V trờn exon 3. Những đột biến này đều nằm trong vựng chức năng của protein CYP1B1 [81].
4.2.2. Mối liờn quan giữa lõm sàng và đột biến gen CYP1B1
Bệnh glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt được xỏc định là một thể bệnh di truyền lặn liờn kết nhiễm sắc thể thường, phổ biến ở trẻ em [5]. Cỏc nghiờn cứu đó xỏc định cú mối liờn quan giữa tỡnh trạng đột biến gen CYP1B1 với đặc điểm lõm sàng cũng như kết quả điều trị của bệnh [11].
Trong nghiờn cứu của chỳng tụi, tổng số cú 86 bệnh nhõn trong đú hai bệnh nhõn là anh em ruột trong một gia đỡnh và cú cựng đột biến gen nờn khi đỏnh giỏ mối liờn quan giữa lõm sàng và đột biến gen, nghiờn cứu tiến hành phõn tớch 85 bệnh nhõn khụng cú mối quan hệ huyết thống với 144 mắt.
4.2.2.1. Mối liờn quan với thời gian xuất hiện bệnh
Nghiờn cứu thấy thời gian phỏt hiện bệnh trung bỡnh trong nhúm bệnh nhõn cú mang đột biến gen CYP1B1 là trước 2 thỏng tuổi (1,21±1,75 thỏng) sớm hơn nhúm khụng mang đột biến (2,99±3,88 thỏng) một cỏch cú ý nghĩa thống kờ với p=0,006. Khi so sỏnh với cỏc nghiờn cứu khỏc cũng cho kết quả tương tự.
Nghiờn cứu của Reddy A. B. ở Ấn Độ (2004) tiến hành trờn 64 bệnh nhõn đó phỏt hiện 24 bệnh nhõn (37,5%) mang đột biến gen CYP1B1. Tất cả cỏc bệnh nhõn này đều xuất hiện bệnh rất sớm trong thỏng đầu sau sinh [58].
Nghiờn cứu của GeyerO. (2010) tiến hành trờn 34 bệnh nhõn của 26 gia đỡnh Israel đó phỏt hiện 17 bệnh nhõn (50%) trong 12 gia đỡnh (46%) mang đột biến gen CYP1B1. Nghiờn cứu đó chỉ ra rằng ở nhúm bệnh nhõn cú đột biến, tuổi xuất hiện bệnh trung bỡnh là 1,3 thỏng sớm hơn nhúm khụng đột biến (4 thỏng) một cỏch cú ý nghĩa thống kờ (p=0,0009) [54].
Nghiờn cứu của Wool Suh (2012) tiến hành trờn 85 bệnh nhõn Hàn Quốc phỏt hiện 22 bệnh nhõn (25,9%) mang đột biến CYP1B1 và 63 bệnh
nhõn khụng mang mang đột biến. Trong đú cú 61,1% bệnh nhõn xuất hiện triệu chứng đầu tiờn trong vũng 6 thỏng tuổi [55].
Nghiờn cứu của Xueli Chen tại Trung Quốc (2013) trờn 238 bệnh nhõn cho thấy tuổi trung bỡnh xuất hiện bệnh ở nhúm mang đột biến là 2 thỏng sớm hơn một cỏch cú ý nghĩa thống kờ so với tuổi trung bỡnh của nhúm khụng mang đột biến là 6 thỏng (p=0,028) [53].
Nghiờn cứu của Christiane Al-Haddad(2016) tại Liban tiến hành trờn 18 bệnh nhõn đó phỏt hiện 6 bệnh nhõn cú đột biến gen CYP1B1 (33%), tuổi phỏt hiện bệnh trung bỡnh là 1,5 thỏng. Khi so sỏnh tuổi xuất hiện bệnh trung bỡnh giữa hai nhúm thấy ở nhúm cú đột biến gen là 0,8 thỏng sớm hơn một
cỏch cú ý nghĩa thống kờ so với nhúm khụng cú đột biến gen là 5,7 thỏng (p=0,01) [56].
Như vậy ở bệnh nhõn biểu hiện bệnh glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt càng sớm càng cần được xột nghiệm đột biến gen CYP1B1 giỳp tỡm hiểu thờm về nguyờn nhõn gõy bệnh.
4.2.2.2. Mối liờn quan với giới tớnh
Trong nghiờn cứu của chỳng tụi tỷ lệ đột biến của bệnh nhõn nam là 25,0% cao hơn tỷ lệ đột biến của nữ là 15,2%, sự khỏc biệt khụng cú ý nghĩa thống kờ (p>0,05). Kết quả này phự hợp với cỏc nghiờn cứu trước đõy chỉ ra rằng tỷ lệ đột biến giữa hai giới khụng khỏc biệt.
Chen (2014) tiến hành nghiờn cứu 192 bệnh nhõn tại Trung Quốc cho thấy tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 của bệnh nhõn nam (18,9%) cao hơn bệnh nhõn nữ (13%). Geyer (2010) tại Israel cũng cho kết quả tương tự, tuy nhiờn sự khỏc biệt về giới tớnh ở hai nhúm trong cỏc nghiờn cứu này đều khụng khỏc biệt cú ý nghĩa thống kờ [53], [54].
4.2.2.3. Mối liờn quan với tiền sử bệnh nhõn và gia đỡnh
Tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 trong nhúm bệnh nhõn cú mẹ bị bệnh khi mang thai là 60,0% cao hơn tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 trong nhúm bệnh nhõn cú mẹ khụng bị bệnh khi mang thai là 18,8%, tuy nhiờn sự khỏc biệt khụng cú ý nghĩa thống kờ với p=0,062 do số liệu khụng đủ lớn, cỏc nghiờn cứu khỏc cũng chưa cú kết luận về vấn đề này.
Nghiờn cứu phỏt hiện 3 gia đỡnh cú tiền sử tiếp xỳc Dioxin. Một trường hợp ụng nội bệnh nhõn cú tiền sử tiếp xỳc với chất độc màu da cam sinh ra bố bệnh nhõn khụng bị bệnh mà mang gen CYP1B1 đột biến ở trạng thỏi dị hợp tử kết hụn với mẹ bệnh nhõn cũng mang một gen đột biến ở trạng thỏi dị hợp. Bệnh nhõn sinh ra mang đột biến gen đồng hợp biểu hiện bệnh cả
hai mắt giai đoạn nặng. Một trường hợp khỏc bà nội bệnh nhõn cú tiền sử tiếp xỳc với chất độc màu da cam. Bà nội và bố bệnh nhõn đều bị glụcụm tuy nhiờn khụng phỏt hiện đột biến gen CYP1B1. Bệnh nhõn là chỏu nội mang đột biến gen CYP1B1 và biểu hiện bệnh glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt. 1 trường hợp bà nội bệnh nhõn tiếp xỳc chất độc da cam, sinh ra bố bệnh nhõn cận thị rất nặng và bệnh nhõn bị bệnh.
Theo cỏc nghiờn cứu trước đõy, chất độc màu da cam (2,3,7,8- tetrachlorodibenzo-p-dioxin) là yếu tố đó được nhiều nghiờn cứu trờn thế giới đề cập đến là nhạy cảm với cDNA gõy đột biến gen CYP1B1 [82], [83], [84]. Nghiờn cứu của Takeuchi (2009) cũng đó tiến hành gõy đột biến thành cụng trờn chuột khi cho tiếp xỳc với chất độc màu da cam, chuột con sinh ra cú biểu hiện bệnh mờ đục cả hai mắt, tuy nhiờn do số lượng phỏt hiện ớt nờn cần nghiờn cứu sõu hơn về vấn đề này [85].
4.2.2.4. Mối liờn quan với số mắt bị bệnh
Để đỏnh giỏ mối liờn quan giữa số mắt bị bệnh với tỡnh trạng đột biến gen CYP1B1, nghiờn cứu phõn tớch kết quả theo 2 chiều đều thấy sự liờn quan chặt chẽ.
Tỷ lệ đột biến trong nhúm bệnh nhõn bị bệnh cả hai mắt cao hơn nhúm bệnh nhõn bị bệnh một mắt cú ý nghĩa thống kờ với p=0,009 và khả năng xuất hiện bệnh ở 2 mắt trong nhúm bệnh nhõn mang đột biến cao gấp 10,12 lần so với nhúm bệnh nhõn khụng mang đột biến. Đõy là yếu tố liờn quan chặt chẽ và quan trọng giữa bệnh glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt và đột biến gen CYP1B1.
Kết quả cũng tương tự như cỏc nghiờn cứu của cỏc tỏc giả khỏc. Nghiờn cứu của Wool Suh (2012) cho thấy tỷ lệ xuất hiện bệnh ở 2 mắt trong nhúm 22 bệnh nhõn mang đột biến CYP1B1 là 81,8%, cao hơn so với nhúm 63 bệnh
nhõn khụng mang đột biến là 61,9% tuy nhiờn sự khỏc biệt khụng cú ý nghĩa