Mồi Trỡnh tự đoạn mồi (5’-3’) Kớch thước (bp)
1F-E1 5′-GAAAGCCTGCTGGTAGAGCTCC-3′
308
1R-E1 5′-CTGCAATCTGGGGACAACGCTG-3′
1F-E2 5’- TCT CCA GAG AGT CAG CTC CG-3’
449
1R-E2 5’-GGG TCG TGG CTG TAC-3’ TCG
2F-E2 5’-ATG GCT TTC GGA CAC TAC T-3’
787
2R-E2 5’-GAT CTT GGT TTT GAG GGG TG-3’
3F-E3 5’-TCC CAG AAA TAT TAA TTT AGT CAC TG-3’
885
3R-E3 5’-TAT GCA GCA CAC CTC ACC TG-3’
Thành phần của phản ứng PCR - thể tớch 20àl gồm: 100ng DNA, 5pmol primer, 200 àmol/l dNTP, 2 đơn vị enzym Taq polymerase và 2àl bufer II 20. Chu trỡnh nhiệt của phản ứng PCR: 94oC-7 phỳt, 35 chu kỳ [94oC–1phỳt, 55oC–1phỳt, 72oC–1phỳt], 72oC - 7phỳt.
Kỹ thuật giải trỡnh tự gen: tinh sạch sản phẩm PCR. Giải trỡnh tự gen theo
quy trỡnh, sử dụng phương phỏp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA).
Quy trỡnh thực hiện: tinh sạch sản phẩm PCR. Phõn tớch 0,1 thể tớch DNA
trờn gel agarose chứa 1àg/ml ethidium bromide. Trộn hỗn hợp trong ống Eppendof gồm: mastemix, Terminator ready Reaction Mix, primer và sản phẩm PCR. Mỗi phản ứng PCR sequencing sử dụng duy nhất một mồi. Chạy mẫu với chu trỡnh nhiệt tối ưu. Tinh chế sản phẩm bằng ABI phenol/ chloroform. Thu tủa DNA bằng ly tõm. Loại bỏ Ethanol. Để khụ. Sản phẩm được chạy trờn mỏy sequencer ABI. Trỡnh tự gen được đối chiếu và so sỏnh với trỡnh tự trờn GenBank (National center for biotechnology information,
NCBI) và phõn tớch theo phương phỏp ABI Prism 310 genetic analyzer (Applied Biosystems).
Kỹ thuật tiến hành phản ứng MLPA
+ Bước 1: Biến tớnh DNA
Cho 5ul dung dịch DNA (nồng độ 1020 ng/ml) cần phõn tớch vào ống PCR, biến tớnh ở 98°C trong 5 phỳt, chuyển về giữ ở 25°C.
+ Bước 2: Gắn (lai) probe vào gen đớch
Chuẩn bị hỗn hợp lai:
Thành phần Thể tớch
Dung dịch đệm MLPA 1,5 ml
Hỗn hợp probe 1,5 ml
Tổng số 3ml
Cho 3 ml hỗn hợp lai vào mẫu DNA đó biến tớnh, nõng nhiệt độ lờn 95°C trong 1 phỳt để biến tớnh probe, hạ nhiệt độ xuống 60°C, ủ qua đờm (1224h). Đõy là nhiệt độ để probe gắn đặc hiệu vào đoạn gen đớch.
+ Bước 3: Nối 2 đầu probe
Chuẩn bị dung dịch đệm gắn probe: cỏc dung dịch húa chất cần vortex nhẹ
cho đều trước khi pha dung dịch đệm. Thành phần gồm cú: dung dịch đệm A 3ml, dung dịch đệm B 3ml, nước 25ml và Enzym ligase 65 1ml.
Cho 32ml dung dịch đệm gắn probevào hỗn hợp lai ủ qua đờm ở trờn khi mẫu ở 54 C, tiếp tục chạy theo chu trỡnh nhiệt sau: 54 C/15phỳt→ 98 C/5phỳt→ 4 C/ . Sản phẩm lai này sẽ lưu trữ được 1 tuần/4 C, hoặc lõu hơn ở -20 C. + Bước 4: Khuếch đại sản phẩm lai (probe)
Dung dịch đệm phản ứng PCR: 4ml dung dịch đệm PCR, 26ml nước. Cho thờm vào hỗn hợp 10ml sản phẩm lai, đưa vào mỏy giữ ở 60 C.
Pha hỗn hợp phản ứng PCR gồm primer (cú gắn huỳnh quang) 2ml, dung dịch đệm 2ml, nước 5,5ml, Tag polymerase 0,5ml. Cho 10ml hỗn hợp phản ứng PCR này vào hỗn hợp đang trong mỏy giữ ở 60 C. Tiếp tục chu trỡnh nhiệt: (95 C/30 giõy, 600C/30 giõy, 720C/1 phỳt) x 35 chu kỳ, 720C/20 phỳt, giữ ở 40C.
Sản phẩm khuếch đại probe sẽ được điện di mao quản huỳnh quang trờn mỏy giải trỡnh tự gen để phõn tớch kết quả.
Sơ đồ nghiờn cứu
Chẩn đoỏn xỏc định bệnh nhõn glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt
Lấy mẫu mỏu bệnh nhõn (2ml) đựng trong ống chống đụng EDTA Giải thớch cho gia đỡnh và kớ cam đoan
chấp nhận tham gia nghiờn cứu Làm hồ sơ bệnh ỏn (đặc điểm lõm sàng, giai đoạn bệnh, điều trị)
Tỏch chiết DNA
Xỏc định đột biến bằng kỹ thuật giải trỡnh tự gen, MLPA
Cú đột biến Khụng cú đột biến
Lấy mẫu mỏu cỏc thành viờn gia đỡnh cú quan hệ huyết thống với bệnh nhõn
Phõn tớch mối liờn quan với lõm sàng Lập và phõn tớch phả hệ So sỏnh GenBank, phần mềm in silico, xỏc định trờn 50 mẫu đối chứng Xỏc định đột biến mới
2.3.4.5. Chỉ số, biến số nghiờn cứuvà tiờu chớ đỏnh giỏ kết quả
Chỉ số và biến số nghiờn cứu
Mục tiờu 1: Xỏc định đột biến gen CYP1B1 và mối liờn quan với lõm sàng trờn bệnh nhõn glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt.
Bệnh nhõn được đỏnh giỏ cỏc biến số và chỉ số về tiền sử bản thõn và gia đỡnh. Tuổi phỏt hiện bệnh được chia thành 3 giai đoạn ≤ 1 thỏng, 1-6 thỏng và > 6 thỏng. Giới, số mắt bị bệnh.
Đo chỉ số nhón ỏp, tớnh trung bỡnh và phõn thành 3 nhúm < 25mmHg, 25-35mmHg, >35mmHg.
Đỏnh giỏ mức độ trong suốt của giỏc mạc, chia 3 mức độ: trong, đục ớt, đục trắng. Đo đường kớnh giỏc mạc, tớnh trung bỡnh và chia 3 nhúm <13mm, 13-14mm, > 14mm.
Từ đú chia bệnh thành 3 giai đoạn nhẹ, trung bỡnh, nặng dựa theo phõn loại giai đoạn của Al-Hazmi.
Dựa trờn kết quả giải trỡnh tự gen CYP1B1, so sỏnh với trỡnh tự trờn GenBank và kết quả giải trỡnh tự gen của nhúm chứng, xỏc định được số lượng, vị trớ, loại đột biến ở bệnh nhõn glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt đồng thời phỏt hiện đột biến mới.
Đỏnh giỏ mối liờn quan giữa đột biến xỏc định được với cỏc đặc điểm lõm sàng như thời gian khởi phỏt bệnh, giai đoạn bệnh, triệu chứng và cỏc dấu hiệu, kết quả đỏp ứng với điều trị.
Mục tiờu 2: Phỏt hiện người lành mang gen bệnh trờn cỏc thành viờn gia đỡnh
cú quan hệ huyết thống với bệnh nhõn glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt.
Lựa chọn cỏc thành viờn gia đỡnh cú quan hệ huyết thống với bệnh nhõn mang đột biến gen. Lấy mỏu xột nghiệm để phỏt hiện người lành mang gen bệnh trờn cỏc thành viờn gia đỡnh cú quan hệ huyết thống với bệnh nhõn dựa trờn kết quả giải trỡnh tự gen CYP1B1.
Phả hệ di truyền là phả hệ cú bố và/ hoặc mẹ bệnh nhõn mang đột biến gen CYP1B1 đột biến di truyền cho con.
Phả hệ khụng di truyền là phả hệ cú bố và mẹ khụng mang đột biến gen CYP1B1 mà đột biến phỏt sinh trong quỏ trỡnh tạo giao tử.
2.3.4.6. Xử lý kết quả
Cỏc số liệu được ghi chộp vào bệnh ỏn nghiờn cứu và xử lý theo thuật toỏn thống kờ y học với phần mềm SPSS 16.0. So sỏnh cỏc biến định lượng bằng T-test, so sỏnh cỏc biến định tớnh bằng Test 2. Mối liờn quan giữa cỏc yếu tố với tỡnh trạng đột biến được đỏnh giỏ thụng qua giỏ trị OR (tỉ suất chờnh) và khoảng tin cậy 95% của OR. Giỏ trị p < 0,05 được coi là cú ý nghĩa thống kờ khi sử dụng để kiểm định sự khỏc biệt về kết quả.
2.4. Vấn đề đạo đức trong nghiờn cứu
Đề tài tuõn thủ chặt chẽ theo đạo đức nghiờn cứu trong Y học. Bệnh nhõn và gia đỡnh hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiờn cứu, cú sự chấp thuận của đại diện bệnh nhõn và/hoặc gia đỡnh bệnh nhõn.
Cỏc gia đỡnh bệnh nhõn cú thể rỳt khỏi nghiờn cứu khi khụng muốn tham gia. Đại diện gia đỡnh bệnh nhõn được thụng bỏo về kết quả xột nghiệm, đồng thời giải thớch về khả năng điều trị và phũng bệnh.
Cỏc thụng tin của bệnh nhõn và gia đỡnh sẽ được đảm bảo bớ mật (cỏc thụng tin về bệnh nhõn, bao gồm cả phần hỏi bệnh, khỏm bệnh và kết quả xột nghiệm chỉ được nhúm nghiờn cứu tiết lộ cho bệnh nhõn và người đại diện gia đỡnh của bệnh nhõn).
Nghiờn cứu được tiến hành hoàn toàn vỡ mục đớch khoa học, lợi ớch của bệnh nhõn và gia đỡnh bệnh nhõn.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU 3.1. Đặc điểm bệnh nhõn glụcụm bẩm sinh nguyờn phỏt
3.1.1. Phõn bố bệnh nhõn theo tuổi phỏt hiện bệnh
Tuổi phỏt hiện bệnh là thời gian tớnh từ khi bệnh nhõn được sinh ra đến khi gia đỡnh phỏt hiện dấu hiệu bất thường đầu tiờn tại mắt của trẻ.