CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.3. Nội dung và phương pháp phân tích
2.3.2. Các tính chất màng mủ trơm – tinh bột
2.3.2.1. Khả năng kháng đâm xuyên
Phép đo thuộc tính cơ học của màng về khả năng kháng đâm xuyên được thực hiện bằng thiết bị đo kết cấu CT3 Texture Analyzer (Brookfield, Mỹ). Trước khi tiến hành các phép đo, các màng đã được bảo quản ở nhiệt độ phòng và độ ẩm tương đối 80% RH trong 48 h.
Khả năng chống đâm xuyên là khả năng chống chịu lực tác động vng góc với màng. Đối với nghiên cứu này, chúng tôi xác định khả năng kháng đâm xuyên theo phương pháp của Saberi và cộng sự, năm 2016. Cắt các màng với kích thước 40×40 mm. Cố định màng bằng hai tấm kẹp, có tâm khuyết trịn ở giữa (đường kính D = 7,8 mm). Sử dụng đầu dị TA-MTP 4R (đường kính d = 4 mm). Thiết lập tốc độ di chuyển của đầu dò là 1.00 mm/s. Lắp đặt đầu dò di chuyển vng góc với màng và đâm thủng màng qua tâm khuyết giữa hai tấm kẹp. Ghi nhận đường cong trở lực - độ biến dạng trong quá trình đo. Các giá trị lực đâm xuyên tối đa (g), độ biến dạng (mm) tại thời điểm màng bị thủng được ghi lại để tính ứng suất đâm xuyên (puncture strength) và độ giãn trước khi thủng (mm), độ cứng của màng. Mỗi mẫu thực hiện lập lại 3 lần. Ứng suất đâm xun được tính theo cơng thức (M. Preis, K. Knop, J. Breitkreutz., 2014):
𝑃 =𝐹
𝐴 (𝑀𝑃𝑎)
25
F là lực đâm xuyên lớn nhất (N)
𝐴 = 𝜋 × (𝑑
2)2 = 12,56 mm2 là diện tích vùng đâm xun, d = 4 mm
Hình 2. 5. Thiết bị đo khả năng kháng đâm xuyên 2.3.2.2. Khả năng kháng kéo giãn 2.3.2.2. Khả năng kháng kéo giãn
Phép đo thuộc tính cơ học của màng về khả năng kháng kéo giãn được thực hiện bằng thiết bị đo kết cấu CT3 Texture Analyzer (Brookfield, Mỹ). Trước khi tiến hành các phép đo, các màng đã được bảo quản ở nhiệt độ phòng (30oC) và độ ẩm tương đối 80% RH trong 48 h.
Cắt các mẫu màng với kích thước 120 × 15 mm. Tiến hành thiết lập các thơng số sau: lực kích hoạt (trigger load) 1 g, tốc độ kéo (test speed) 1,00 mm.s. Sau đó dán cố định hai đầu mẫu màng vào 2 trục của thiết bị có Ø = 17,8 mm. Khoảng cách ban đầu giữa 2 trục, tính từ tâm của 2 trục là 45 mm. Tiến hành cho máy đo chạy, trục trên bắt đầu đi lên kéo màng giãn dài tới khi đứt hồn tồn thì dừng. Mỗi mẫu được đo lặp lại 3 lần.
Độ giãn dài của màng được tính theo cơng thức (Standard & ISO, 1996):
𝜀 =∆𝐿
𝐿0 × 100 (%)
Trong đó:
Ɛ: là giá trị độ biến dạng của màng khi đứt được tính bằng tỷ lệ phần trăm (%) L0: là chiều dài ban đầu của mẫu (mm) (L0 = 45 mm)
26
ΔL: là chiều dài tăng thêm của mẫu (mm)
Hình 2. 6. Thiết bị đo khả năng kháng kéo giãn 2.3.2.3. Độ ẩm, khả năng hấp thụ nước, khả năng hòa tan 2.3.2.3. Độ ẩm, khả năng hấp thụ nước, khả năng hịa tan
Chúng tơi đã thực hiện nghiên cứu này dựa theo phương pháp của Thi Luyen Cao (2019b) (Cao, T. L., & Song, K. B. , 2019b). Tuy nhiên vẫn có một vài thay đổi nhỏ trong thí nghiệm nhằm tạo điều kiện thuận lợi và phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm sẵn có.
Cắt các màng với kích thước 30×30 mm và đem sấy khơ các mẫu màng (W0) ở 105°C trong 24 h, sau đó cân xác định khối lượng sau sấy (W1). Sau khi sấy xong ngâm các màng trong 20 mL nước cất ở nhiệt độ phịng. Sau 24 h, màng được làm khơ bề mặt bằng khăn giấy sạch và được cân lại (W2). Tiếp tục đem sấy các mẫu màng đã được làm khô bớt nước trong 24 h ở 105°C, sau khi sấy xong cân các màng (W3). Mỗi mẫu được đo lặp lại 3 lần.
Độ ẩm (Moisture content, MC) được xác định theo cơng thức sau:
MC =𝑊0− 𝑊1
𝑊0 × 100 (%)
Khả năng hấp thụ nước (water uptake, WU) được xác định theo công thức sau:
WU =𝑊2− 𝑊3
𝑊3 × 100 (%)
27 Ws =𝑊3 − 𝑊1
𝑊1 × 100 (%)
Trong đó:
W0 là khối lượng màng ban đầu (g) W1 là khối lượng màng sau khi sấy (g)
W2 là khối lượng màng sau khi ngâm nước (g) W3 là khối lượng màng sấy sau khi ngâm (g)
2.3.2.4. Khả năng thấm ẩm
Khả năng thấm ẩm (Water vapor permeability-WVP) của màng được xác định theo phương pháp ASTM E-96 và có một vài thay đổi (Standard & ISO, 1996).Phương pháp được thực hiện bằng cách chuẩn bị các cốc thủy tinh có đường kính trong 40 mm, đường kính ngồi 50 mm và chiều cao 65 mm. Bỏ silicagel đã sấy khô vào cốc để tạo độ ẩm tương đối 0% bên trong cốc. Các mẫu màng được gắn lên miệng cốc và dùng nắp gắn chặt lên. Trên nắp đã được khoét một lỗ trịn có đường kính 40 mm. Sau đó đặt trong mơi trường với độ ẩm tương đối khoảng 80% RH ở nhiệt độ phòng. Tiến hành cân khối lượng các cốc 1 h/1 lần trong 48 h. Khả năng thấm ẩm được xác định từ sự tăng khối lượng của cốc sau 1h. Dựng đồ thị dựa trên hồi quy tuyến tính (r2 > 0,99) từ những dữ liệu về khối lượng cốc tăng lên và thời gian, để xác định độ dốc của đường thẳng. Tốc độ truyền ẩm (Water vapor transmission rate-WVTR) được xác định bằng cách chia độ dốc K (g/h) cho diện tích truyền ẩm A (m2). Khả năng thấm ẩm WVP được xác định theo công thức (Babak Ghanbarzadeha, Hadi Almasia, Ali A. Entezamib., 2011):
WVP được xác định bởi công thức sau:
WVP = WVTR
𝑃 × (𝑅𝐻2− 𝑅𝐻1)× 𝑋 (𝑔/ 𝑃𝑎. 𝑚. 𝑠)
Trong đó: 𝑊𝑉𝑇𝑅 = 𝐾
𝐴 (A = 4 m2)
P là áp suất hơi nước bão hịa (Pa) ở nhiệt độ tiến hành thí nghiệm, P = 3167Pa (Babak Ghanbarzadeha, Hadi Almasia, Ali A. Entezamib., 2011)
RH1 là độ ẩm bên ngoài cốc (80% RH) và RH2 là độ ẩm bên trong cốc (0%) X là độ dày của màng (m)
28
Hình 2. 7. Cốc sử dụng để đo khả năng thấm ẩm 2.3.2.5. Khả năng chống oxy hóa 2.3.2.5. Khả năng chống oxy hóa
Khả năng chống oxy hóa của màng được thực hiện theo phương pháp đo hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của Yichao Ma và cộng sự (2017) với một vài thay đổi (Yichao Ma, Li, L., & Wang, Y. , 2017).
Hòa tan 2,5 mg DPPH tromg 100 mL ethanol 99,5% để chuẩn bị dung dịch DPPH 0,063 mM. Cắt 0,4 g mỗi mẫu màng chứa cinnamaldehyde cho vào các cuvet thủy tinh chứa 3,0 mL DPPH 0,063 mM. Một cuvet chứa mẫu đối chứng âm bao gồm 3,0 mL dung dịch DPPH 0,063 mM và 200 µL ethanol 99,5%. Cứ mỗi 1 h, đo theo thời gian độ hấp thụ của các cuvet chứa mẫu cần đo và cuvet đối chứng. Mỗi cuvet được đo với một blank riêng. Cuvet đối chứng với mẫu blank là 3,2 mL ethanol 99,5%. Cuvet 4 mẫu màng cần đo với 4 mẫu blank là 0,4 g màng và 3,0 mL ethanol 99,5%.
Đo độ hấp thụ các dung dịch ở bước sóng 515 nm trong 24 h. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Phần trăm độ hấp thụ DPPH giảm tại thời điểm t được tính theo công thức: % độ hấp thụ DPPH giảm = (𝐴0 − 𝐴𝑡 )−(𝐴0 Đ𝐶 − 𝐴𝑡 Đ𝐶)
𝐴0 × 100 (%)
Trong đó:
A0: độ hấp thụ của mẫu màng tại thời điểm t0 At: độ hấp thụ của mẫu màng tại thời điểm t
A0 ĐC: độ hấp thụ của mẫu đối chứng tại thời điểm t0 At ĐC: độ hấp thụ của mẫu đối chứng tại thời điểm t
29
2.3.2.6. Phổ hấp thụ UV – Vis và độ truyền quang
Độ trong suốt của màng được xác định bằng cách đo phần trăm ánh sáng truyền qua bằng thiết bị đo quang phổ UV-Vis (UH-3500 Hitachi). Chuẩn bị các mẫu màng có kích thước 12×40 mm. Đặt trực tiếp các màng vào khe để cuvet trong máy quang phổ, vng góc với chùm sáng. Phép đo được thực hiện bằng cách sử dụng khơng khí làm tham chiếu. Phổ của mỗi màng thu được ở bước sóng 200 – 1100 nm. Xác định giá trị trung bình phần trăm ánh sáng truyền qua tại ba vùng bước sóng: vùng UV 200 – 380 nm, vùng ánh sáng thấy 380 – 700 nm, vùng hồng ngoại 700 -1100nm.
2.3.2.7. Xác định độ dày của màng
Độ dày của các mẫu màng được đo bằng thước kẹp điện tử sau khi bảo quản ở môi trường chứa NaCl bão hịa trong vịng 24 h. Đo 10 vị trí khác nhau của màng, tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn. Độ chính xác của thước là ± 0,01 mm.
2.3.2.8. Khả năng kháng nấm mốc
Chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu này dựa theo phương pháp của Mari Pau Balaguer (2014) và U.K. Aruna Nair (2020) (Balaguer, M. P., Fajardo, P., Gartner., 2014) và ( Nair, U. A., Selvam, S. P., Dharini, V., Nambiar, R. B., 2020). Tuy nhiên vẫn có một vài thay đổi nhỏ trong thí nghiệm nhằm tạo điều kiện thuận lợi và phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm sẵn có.
Chuẩn bị mơi trường nuôi cấy nấm mốc (2% agar, 2% Nutrient Broth (NB), 8 ppm thuốc kháng sinh (chloramphenicol). Đổ môi trường vào các đĩa petri sau khi đã tiệt trùng môi trường và đĩa. Đợi mơi trường đơng lại hồn tồn và nguội tới nhiệt độ phòng. Tiến hành cấy nấm mốc lên môi trường và đặt các màng ( được cắt hình trịn với đường kính 10mm) lên mơi trường đã cấy nấm mốc. Tiến hành quan sát sự phát triển của nấm mốc trên đĩa chứa màng sau 24 h, 48 h và 52 h. Ghi nhận và chụp hình lại kết quả nhận được.
2.3.2.9. Khả năng kháng vi khuẩn
Phương pháp đánh giá khả năng diệt khuẩn của chúng tôi được dựa trên nghiên cứu của Zain (2014) (Zain, N. M. , 2014). Chủng giống Escherichia coli NBRC 14237 được bảo quản ở nhiệt độ dưới 4 °C và được cấy truyền vào mơi trường Nutrient Broth (NB), sau đó được ủ trong tủ cấy 37 °C trong vòng 24 h để E.Coli sinh trưởng. Chủng giống sau khi ủ trong tủ cấy có mật độ ban đầu xấp xỉ 107 cfu/mL. Chúng tơi tiến hành pha lỗng mẫu huyền phù sinh vật này với
30
dung dịch nước muối sinh lý (0,9% NaCl) để đạt được mật độ ban đầu xấp xỉ 105 (cfu/mL) và sử dụng mật độ trên để đánh giá khả năng kháng khuẩn của màng.
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi khuẩn E.Coli (2,2% agar, 1,3% NB). Đổ môi trường vào các đĩa petri sau khi đã tiệt trùng môi trường và đĩa petri. Đợi đến khi môi trường đông lại và nguội đến nhiệt độ phịng thì tiến hành trải đĩa, lấy 100 µL huyền phù vi khuẩn cho vào mơi trường, sử dụng que cấy tam giác để trải đều vi khuẩn lên trên bề mặt thạch. Đặt các màng đã chuẩn bị sẵn (cắt hình trịn có đường kính 10 mm) vào mơi trường đã cấy vi khuẩn. Tiến hành quan sát khả năng vi khuẩn của màng sau 24 h, 48 h và 52 h. Ghi nhận và chụp hình lại kết quả nhận được.
2.3.2.10. Phương pháp xử lí số liệu thống kê
Tất cả các mẫu được lặp lại ba lần và số liệu được xử lý bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA). Các phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm SPSS (SPSS Institute Inc., Cary, NC, USA) với kiểm định đa khoảng Ducan (Ducan’s Multiple RangeTest) (p ≤ 0,05) để phân tích sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị.
31
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
3.1. Các tính chất của mủ trôm nguyên thủy, mủ trôm thủy phân, mủ trơm oxy hóa, mủ trơm thủy phân và oxy hóa
Mủ trơm ngun thủy có độ tan rất kém, do chứa nhiều nhóm acetyl vì thế việc thủy phân mủ trôm bằng kiềm sẽ giúp tăng độ hịa tan của chúng trong nước. Ngồi ra mủ trôm nguyên thủy và thủy phân chủ yếu có các nhóm chức COOH và OH vậy nên việc tạo thêm các nhóm chức bằng cách oxy hóa bởi NaIO4 sẽ làm tăng khả năng phản ứng của mủ trơm. Thực tế q trình oxy hóa này đã được thực hiện nhiều trên tinh bột, cellulose, CMC,… tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về việc oxy hóa mủ trơm, do đó chúng tơi tiến hành thực hiện nghiên cứu này nhằm cho phép mở rộng phạm vi ứng dụng của chúng.
3.1.1. Phổ FTIR
Hình 3. 1. Phổ FTIR của các mẫu mủ trôm
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 1725 887 885 1244 1375 1725 1244 1375 3290 3380 3394 TP 1725 NT 3282 OXH Tra nsm itt a nce Wavenumber (cm-1)
Nguyên thủy Oxy hóa
Thủy phân Thủy phân - Oxy hóa
32
Bảng 3. 1. Phân tích phổ hồng ngoại của các mẫu mủ trôm
Wavenumber (cm-1) Liên kết
3282, 3290, 3380, 3394 OH
1725 C=O (nhóm aldehyde hoặc ester-nhóm acetyl)
1375 C-H (của methyl- nhóm acetyl)
1244 C=O (ester- nhóm acetyl)
885, 887 Hemiacetal
Phổ FTIR hoạt động dựa trên sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại của vật chất cần nghiên cứu, cho phép ghi nhận các dao động đặc trưng của các liên kết hóa học giữa các nguyên tử để thấy được những thay đổi trong cấu trúc của mủ trôm trước và sau khi biến tính.
Hình 3.1 và bảng 3.1 cho thấy số sóng hấp thụ ở 3282, 3290, 3380, 3394 cm-1 đặc trưng cho sự có mặt của nhóm hydroxyl trong cấu trúc của mủ trôm (Hana Postulkova, Ivana Chamradova, David Pavlinak. , 2017) và của nước hấp phụ. Việc đỉnh hấp thụ có số sóng cao nhất 3394 cm-1 đối với mẫu mủ trơm oxy hóa và lần lượt giảm xuống 3380, 3290, 3282 cm-1 với mẫu mủ trôm thủy phân – oxy hóa, nguyên thủy, thủy phân. Tương ứng với đó, cường độ đỉnh hấp thụ tăng dần. Kết quả có thể được giải thích là do sau khi thủy phân nhóm acetyl được thay thế bằng nhóm OH, làm tăng số nhóm OH trong cấu trúc của mủ trơm thủy phân, tăng số liên kết hydro. Q trình oxy hóa làm giảm lượng nhóm OH do chuyển thành nhóm aldehyde dẫn tới ái lực với nước thấp hơn. Mẫu mủ trơm thủy phân – oxy hóa sau khi thủy phân đã loại bỏ nhóm acetyl, nhóm OH được tăng thêm nhưng qua bước oxy hóa, việc tạo thành nhóm aldehyde một phần đã tương tác với nhóm OH tạo hemiacetal và acetal. Dẫn đến hàm lượng nhóm OH giảm xuống đáng kể so với mẫu nguyên thủy.
Dao động của liên kết ester (nhóm acetyl liên kết với mạch phân tử mủ trôm thông qua liên kết ester) ở 1725 và 1244 cm-1 (Hana Postulkova, Ivana Chamradova, David Pavlinak. , 2017), cùng với đó là vùng dao động C-H của methyl từ acetyl (Ramoji, A., Yenagi, J., Tonannavar, J., Jadhav, V. B., 2010) cho thấy sự có mặt của nhóm acetyl trong cấu trúc của mủ trôm. Ở phổ hồng ngoại của mủ trôm thủy phân và thủy phân – oxy hóa có thể thấy sự mất đi gần như hoàn toàn của đỉnh 1725 và 1244 cm-1, điều đó có nghĩa là các nhóm acetyl đã bị loại bỏ khỏi cấu trúc. Ngoài ra, nhánh ở số sóng 1375 cm-1 được liên kết với nhóm acetyl khơng có
33
tại hai mẫu trên. Điều này cũng được báo cáo trong nghiên cứu của Brito và cộng sự về các đặc điểm tính chất của karaya gum (Brito, A. C. F., Silva, D. A., de Paula, R. C., & Feitosa, J. P. , 2004).
Quá trình oxy hóa bằng NaIO4 chủ yếu phá vỡ liên kết liên kết C – C khi trên mỗi nguyên tử C này mang một nhóm OH trên các đơn vị đường, các nhóm aldehyde được hình thành và thay thế các nhóm C – OH. Đỉnh đặc trưng cho nhóm C=O của aldehyde ở 1725 cm-1 (Zhang, S. D., Zhang, Y. R., Zhu, J., Wang, X. L., Yang, K. K., 2007) có cường độ cao đối với mẫu mủ trơm oxy hóa, cho thấy hàm lượng nhóm aldehyde lớn. Tuy nhiên mẫu mủ trơm thủy phân – oxy hóa có cường độ rất yếu do sự hình thành hemiacetal và acetal. Theo Changdao Mu và cộng sự, độ hấp thụ ở số sóng 880 cm-1 thể hiện liên kết hemiacetal giữa các nhóm aldehyde và nhóm hydroxyl gần kề (Changdao Mu, Guo, J., Li, X., Lin., 2012). Tương tự nghiên cứu của chúng tơi khi tìm thấy mẫu mủ trơm thủy phân – oxy hóa và oxy hóa có độ hấp thụ dao động lần lượt ở 887 và 885 cm-1. Mặt khác, mủ trôm thủy phân – oxy hóa có nhóm hydroxyl nhiều hơn mủ trơm oxy hóa do q trình thủy phân nên liên kết hemiacetyl hình thành nhiều hơn, do đó giảm hàm lượng nhóm aldehyde. Jiugao Yu và cộng sự cũng báo cáo rằng đỉnh đặc trưng cho nhóm C=O ở 1735 cm-1 có cường độ mạnh với sự gia tăng hàm lượng aldehyde của tinh bột oxy hóa (Jiugao Yu, Chang, P. R., & Ma, X. , 2010).
3.1.2. Độ tan
Độ tan của mủ trôm nguyên thủy là 0,018%, kết quả này tương tự như một nghiên cứu của Hana Postulkova (2017) rằng mủ trơm có độ tan là 0,02%. Độ tan của mủ trôm thủy phân là 0,226% tăng gấp hơn 10 lần so với mủ trôm nguyên thủy. Độ tan của mủ trơm đã oxy hóa là 0,011% thấp hơn (p<0,05) so với độ tan của mủ trôm nguyên thủy 1,8 lần và thủy phân – oxy hóa là 0,015% cũng thấp như mủ trơm oxy hóa.
Độ tan của mủ trôm nguyên thủy thấp là do ảnh hưởng của nhóm acetyl. Các nhóm acetyl góp phần vào tính khơng hịa tan của mủ trơm trong nước do đặc tính kỵ nước của nhóm methyl.