CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.3. Nội dung và phương pháp phân tích
2.3.2.4. Khả năng thấm ẩm
Khả năng thấm ẩm (Water vapor permeability-WVP) của màng được xác định theo phương pháp ASTM E-96 và có một vài thay đổi (Standard & ISO, 1996).Phương pháp được thực hiện bằng cách chuẩn bị các cốc thủy tinh có đường kính trong 40 mm, đường kính ngồi 50 mm và chiều cao 65 mm. Bỏ silicagel đã sấy khô vào cốc để tạo độ ẩm tương đối 0% bên trong cốc. Các mẫu màng được gắn lên miệng cốc và dùng nắp gắn chặt lên. Trên nắp đã được khoét một lỗ trịn có đường kính 40 mm. Sau đó đặt trong mơi trường với độ ẩm tương đối khoảng 80% RH ở nhiệt độ phòng. Tiến hành cân khối lượng các cốc 1 h/1 lần trong 48 h. Khả năng thấm ẩm được xác định từ sự tăng khối lượng của cốc sau 1h. Dựng đồ thị dựa trên hồi quy tuyến tính (r2 > 0,99) từ những dữ liệu về khối lượng cốc tăng lên và thời gian, để xác định độ dốc của đường thẳng. Tốc độ truyền ẩm (Water vapor transmission rate-WVTR) được xác định bằng cách chia độ dốc K (g/h) cho diện tích truyền ẩm A (m2). Khả năng thấm ẩm WVP được xác định theo công thức (Babak Ghanbarzadeha, Hadi Almasia, Ali A. Entezamib., 2011):
WVP được xác định bởi cơng thức sau:
WVP = WVTR
𝑃 × (𝑅𝐻2− 𝑅𝐻1)× 𝑋 (𝑔/ 𝑃𝑎. 𝑚. 𝑠)
Trong đó: 𝑊𝑉𝑇𝑅 = 𝐾
𝐴 (A = 4 m2)
P là áp suất hơi nước bão hòa (Pa) ở nhiệt độ tiến hành thí nghiệm, P = 3167Pa (Babak Ghanbarzadeha, Hadi Almasia, Ali A. Entezamib., 2011)
RH1 là độ ẩm bên ngoài cốc (80% RH) và RH2 là độ ẩm bên trong cốc (0%) X là độ dày của màng (m)
28
Hình 2. 7. Cốc sử dụng để đo khả năng thấm ẩm 2.3.2.5. Khả năng chống oxy hóa 2.3.2.5. Khả năng chống oxy hóa
Khả năng chống oxy hóa của màng được thực hiện theo phương pháp đo hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của Yichao Ma và cộng sự (2017) với một vài thay đổi (Yichao Ma, Li, L., & Wang, Y. , 2017).
Hòa tan 2,5 mg DPPH tromg 100 mL ethanol 99,5% để chuẩn bị dung dịch DPPH 0,063 mM. Cắt 0,4 g mỗi mẫu màng chứa cinnamaldehyde cho vào các cuvet thủy tinh chứa 3,0 mL DPPH 0,063 mM. Một cuvet chứa mẫu đối chứng âm bao gồm 3,0 mL dung dịch DPPH 0,063 mM và 200 µL ethanol 99,5%. Cứ mỗi 1 h, đo theo thời gian độ hấp thụ của các cuvet chứa mẫu cần đo và cuvet đối chứng. Mỗi cuvet được đo với một blank riêng. Cuvet đối chứng với mẫu blank là 3,2 mL ethanol 99,5%. Cuvet 4 mẫu màng cần đo với 4 mẫu blank là 0,4 g màng và 3,0 mL ethanol 99,5%.
Đo độ hấp thụ các dung dịch ở bước sóng 515 nm trong 24 h. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Phần trăm độ hấp thụ DPPH giảm tại thời điểm t được tính theo cơng thức: % độ hấp thụ DPPH giảm = (𝐴0 − 𝐴𝑡 )−(𝐴0 Đ𝐶 − 𝐴𝑡 Đ𝐶)
𝐴0 × 100 (%)
Trong đó:
A0: độ hấp thụ của mẫu màng tại thời điểm t0 At: độ hấp thụ của mẫu màng tại thời điểm t
A0 ĐC: độ hấp thụ của mẫu đối chứng tại thời điểm t0 At ĐC: độ hấp thụ của mẫu đối chứng tại thời điểm t
29
2.3.2.6. Phổ hấp thụ UV – Vis và độ truyền quang
Độ trong suốt của màng được xác định bằng cách đo phần trăm ánh sáng truyền qua bằng thiết bị đo quang phổ UV-Vis (UH-3500 Hitachi). Chuẩn bị các mẫu màng có kích thước 12×40 mm. Đặt trực tiếp các màng vào khe để cuvet trong máy quang phổ, vng góc với chùm sáng. Phép đo được thực hiện bằng cách sử dụng khơng khí làm tham chiếu. Phổ của mỗi màng thu được ở bước sóng 200 – 1100 nm. Xác định giá trị trung bình phần trăm ánh sáng truyền qua tại ba vùng bước sóng: vùng UV 200 – 380 nm, vùng ánh sáng thấy 380 – 700 nm, vùng hồng ngoại 700 -1100nm.
2.3.2.7. Xác định độ dày của màng
Độ dày của các mẫu màng được đo bằng thước kẹp điện tử sau khi bảo quản ở mơi trường chứa NaCl bão hịa trong vịng 24 h. Đo 10 vị trí khác nhau của màng, tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn. Độ chính xác của thước là ± 0,01 mm.
2.3.2.8. Khả năng kháng nấm mốc
Chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu này dựa theo phương pháp của Mari Pau Balaguer (2014) và U.K. Aruna Nair (2020) (Balaguer, M. P., Fajardo, P., Gartner., 2014) và ( Nair, U. A., Selvam, S. P., Dharini, V., Nambiar, R. B., 2020). Tuy nhiên vẫn có một vài thay đổi nhỏ trong thí nghiệm nhằm tạo điều kiện thuận lợi và phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm sẵn có.
Chuẩn bị mơi trường ni cấy nấm mốc (2% agar, 2% Nutrient Broth (NB), 8 ppm thuốc kháng sinh (chloramphenicol). Đổ môi trường vào các đĩa petri sau khi đã tiệt trùng môi trường và đĩa. Đợi mơi trường đơng lại hồn tồn và nguội tới nhiệt độ phòng. Tiến hành cấy nấm mốc lên mơi trường và đặt các màng ( được cắt hình trịn với đường kính 10mm) lên mơi trường đã cấy nấm mốc. Tiến hành quan sát sự phát triển của nấm mốc trên đĩa chứa màng sau 24 h, 48 h và 52 h. Ghi nhận và chụp hình lại kết quả nhận được.
2.3.2.9. Khả năng kháng vi khuẩn
Phương pháp đánh giá khả năng diệt khuẩn của chúng tôi được dựa trên nghiên cứu của Zain (2014) (Zain, N. M. , 2014). Chủng giống Escherichia coli NBRC 14237 được bảo quản ở nhiệt độ dưới 4 °C và được cấy truyền vào mơi trường Nutrient Broth (NB), sau đó được ủ trong tủ cấy 37 °C trong vịng 24 h để E.Coli sinh trưởng. Chủng giống sau khi ủ trong tủ cấy có mật độ ban đầu xấp xỉ 107 cfu/mL. Chúng tơi tiến hành pha lỗng mẫu huyền phù sinh vật này với
30
dung dịch nước muối sinh lý (0,9% NaCl) để đạt được mật độ ban đầu xấp xỉ 105 (cfu/mL) và sử dụng mật độ trên để đánh giá khả năng kháng khuẩn của màng.
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi khuẩn E.Coli (2,2% agar, 1,3% NB). Đổ môi trường vào các đĩa petri sau khi đã tiệt trùng môi trường và đĩa petri. Đợi đến khi môi trường đông lại và nguội đến nhiệt độ phịng thì tiến hành trải đĩa, lấy 100 µL huyền phù vi khuẩn cho vào mơi trường, sử dụng que cấy tam giác để trải đều vi khuẩn lên trên bề mặt thạch. Đặt các màng đã chuẩn bị sẵn (cắt hình trịn có đường kính 10 mm) vào môi trường đã cấy vi khuẩn. Tiến hành quan sát khả năng vi khuẩn của màng sau 24 h, 48 h và 52 h. Ghi nhận và chụp hình lại kết quả nhận được.
2.3.2.10. Phương pháp xử lí số liệu thống kê
Tất cả các mẫu được lặp lại ba lần và số liệu được xử lý bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA). Các phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm SPSS (SPSS Institute Inc., Cary, NC, USA) với kiểm định đa khoảng Ducan (Ducan’s Multiple RangeTest) (p ≤ 0,05) để phân tích sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị.
31
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
3.1. Các tính chất của mủ trơm ngun thủy, mủ trơm thủy phân, mủ trơm oxy hóa, mủ trơm thủy phân và oxy hóa
Mủ trơm ngun thủy có độ tan rất kém, do chứa nhiều nhóm acetyl vì thế việc thủy phân mủ trơm bằng kiềm sẽ giúp tăng độ hịa tan của chúng trong nước. Ngồi ra mủ trôm nguyên thủy và thủy phân chủ yếu có các nhóm chức COOH và OH vậy nên việc tạo thêm các nhóm chức bằng cách oxy hóa bởi NaIO4 sẽ làm tăng khả năng phản ứng của mủ trơm. Thực tế q trình oxy hóa này đã được thực hiện nhiều trên tinh bột, cellulose, CMC,… tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về việc oxy hóa mủ trơm, do đó chúng tơi tiến hành thực hiện nghiên cứu này nhằm cho phép mở rộng phạm vi ứng dụng của chúng.
3.1.1. Phổ FTIR
Hình 3. 1. Phổ FTIR của các mẫu mủ trôm
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 1725 887 885 1244 1375 1725 1244 1375 3290 3380 3394 TP 1725 NT 3282 OXH Tra nsm itt a nce Wavenumber (cm-1)
Nguyên thủy Oxy hóa
Thủy phân Thủy phân - Oxy hóa
32
Bảng 3. 1. Phân tích phổ hồng ngoại của các mẫu mủ trôm
Wavenumber (cm-1) Liên kết
3282, 3290, 3380, 3394 OH
1725 C=O (nhóm aldehyde hoặc ester-nhóm acetyl)
1375 C-H (của methyl- nhóm acetyl)
1244 C=O (ester- nhóm acetyl)
885, 887 Hemiacetal
Phổ FTIR hoạt động dựa trên sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại của vật chất cần nghiên cứu, cho phép ghi nhận các dao động đặc trưng của các liên kết hóa học giữa các nguyên tử để thấy được những thay đổi trong cấu trúc của mủ trơm trước và sau khi biến tính.
Hình 3.1 và bảng 3.1 cho thấy số sóng hấp thụ ở 3282, 3290, 3380, 3394 cm-1 đặc trưng cho sự có mặt của nhóm hydroxyl trong cấu trúc của mủ trôm (Hana Postulkova, Ivana Chamradova, David Pavlinak. , 2017) và của nước hấp phụ. Việc đỉnh hấp thụ có số sóng cao nhất 3394 cm-1 đối với mẫu mủ trơm oxy hóa và lần lượt giảm xuống 3380, 3290, 3282 cm-1 với mẫu mủ trơm thủy phân – oxy hóa, ngun thủy, thủy phân. Tương ứng với đó, cường độ đỉnh hấp thụ tăng dần. Kết quả có thể được giải thích là do sau khi thủy phân nhóm acetyl được thay thế bằng nhóm OH, làm tăng số nhóm OH trong cấu trúc của mủ trơm thủy phân, tăng số liên kết hydro. Q trình oxy hóa làm giảm lượng nhóm OH do chuyển thành nhóm aldehyde dẫn tới ái lực với nước thấp hơn. Mẫu mủ trơm thủy phân – oxy hóa sau khi thủy phân đã loại bỏ nhóm acetyl, nhóm OH được tăng thêm nhưng qua bước oxy hóa, việc tạo thành nhóm aldehyde một phần đã tương tác với nhóm OH tạo hemiacetal và acetal. Dẫn đến hàm lượng nhóm OH giảm xuống đáng kể so với mẫu nguyên thủy.
Dao động của liên kết ester (nhóm acetyl liên kết với mạch phân tử mủ trôm thông qua liên kết ester) ở 1725 và 1244 cm-1 (Hana Postulkova, Ivana Chamradova, David Pavlinak. , 2017), cùng với đó là vùng dao động C-H của methyl từ acetyl (Ramoji, A., Yenagi, J., Tonannavar, J., Jadhav, V. B., 2010) cho thấy sự có mặt của nhóm acetyl trong cấu trúc của mủ trôm. Ở phổ hồng ngoại của mủ trôm thủy phân và thủy phân – oxy hóa có thể thấy sự mất đi gần như hồn tồn của đỉnh 1725 và 1244 cm-1, điều đó có nghĩa là các nhóm acetyl đã bị loại bỏ khỏi cấu trúc. Ngồi ra, nhánh ở số sóng 1375 cm-1 được liên kết với nhóm acetyl khơng có
33
tại hai mẫu trên. Điều này cũng được báo cáo trong nghiên cứu của Brito và cộng sự về các đặc điểm tính chất của karaya gum (Brito, A. C. F., Silva, D. A., de Paula, R. C., & Feitosa, J. P. , 2004).
Q trình oxy hóa bằng NaIO4 chủ yếu phá vỡ liên kết liên kết C – C khi trên mỗi nguyên tử C này mang một nhóm OH trên các đơn vị đường, các nhóm aldehyde được hình thành và thay thế các nhóm C – OH. Đỉnh đặc trưng cho nhóm C=O của aldehyde ở 1725 cm-1 (Zhang, S. D., Zhang, Y. R., Zhu, J., Wang, X. L., Yang, K. K., 2007) có cường độ cao đối với mẫu mủ trơm oxy hóa, cho thấy hàm lượng nhóm aldehyde lớn. Tuy nhiên mẫu mủ trơm thủy phân – oxy hóa có cường độ rất yếu do sự hình thành hemiacetal và acetal. Theo Changdao Mu và cộng sự, độ hấp thụ ở số sóng 880 cm-1 thể hiện liên kết hemiacetal giữa các nhóm aldehyde và nhóm hydroxyl gần kề (Changdao Mu, Guo, J., Li, X., Lin., 2012). Tương tự nghiên cứu của chúng tơi khi tìm thấy mẫu mủ trơm thủy phân – oxy hóa và oxy hóa có độ hấp thụ dao động lần lượt ở 887 và 885 cm-1. Mặt khác, mủ trơm thủy phân – oxy hóa có nhóm hydroxyl nhiều hơn mủ trơm oxy hóa do q trình thủy phân nên liên kết hemiacetyl hình thành nhiều hơn, do đó giảm hàm lượng nhóm aldehyde. Jiugao Yu và cộng sự cũng báo cáo rằng đỉnh đặc trưng cho nhóm C=O ở 1735 cm-1 có cường độ mạnh với sự gia tăng hàm lượng aldehyde của tinh bột oxy hóa (Jiugao Yu, Chang, P. R., & Ma, X. , 2010).
3.1.2. Độ tan
Độ tan của mủ trôm nguyên thủy là 0,018%, kết quả này tương tự như một nghiên cứu của Hana Postulkova (2017) rằng mủ trơm có độ tan là 0,02%. Độ tan của mủ trôm thủy phân là 0,226% tăng gấp hơn 10 lần so với mủ trôm nguyên thủy. Độ tan của mủ trơm đã oxy hóa là 0,011% thấp hơn (p<0,05) so với độ tan của mủ trôm nguyên thủy 1,8 lần và thủy phân – oxy hóa là 0,015% cũng thấp như mủ trơm oxy hóa.
Độ tan của mủ trơm ngun thủy thấp là do ảnh hưởng của nhóm acetyl. Các nhóm acetyl góp phần vào tính khơng hịa tan của mủ trơm trong nước do đặc tính kỵ nước của nhóm methyl. Nhóm acetyl có thể được gắn vào mạch cấu trúc của mủ trơm thơng qua oxy ở vị trí carbon thứ sáu trên đơn vị galactose vì nhóm hydroxyl bậc 1 phản ứng mạnh hơn nhóm hydroxyl bậc 2. Các nhóm acetyl được loại bỏ nhờ phản ứng với NaOH 1M. Xử lí bằng kiềm mạnh có thể thay thế ít nhất là một phần của các ion đa hóa trị thành các ion hóa trị một (hình 1.3). Điều đó cũng
34
góp phần làm tăng độ hịa tan của mủ trôm. Trong một nghiên cứu của Hanna Postulkova và cộng sự (2017) cũng báo cáo rằng điều kiện tối ưu để làm tăng độ hịa tan của mủ trơm khi thủy phân bằng NaOH 1 M và KOH 1 M với độ phân tán mủ trơm là 2% trong nước cất ở nhiệt độ phịng (Hana Postulkova, Ivana Chamradova, David Pavlinak. , 2017). Vì thế, độ tan của mủ trôm tăng lên hơn 10 lần so với mủ trôm nguyên thủy, độ tan của mủ trôm tăng giúp tăng khả năng ứng dụng mới của mủ trôm. Một nghiên cứu của Le Cerf, D. (1990) cũng đã chỉ ra độ hòa tan trong nước của mủ trôm phụ thuộc vào việc giảm hàm lượng acetyl (Le Cerf, D., Irinei, F., & Muller, G. , 1990).
Hình 3. 2. Độ tan của mủ trơm trước và sau khi biến tính
Độ tan của mủ trơm oxy hóa và thủy phân – oxy hóa thấp là do đặc trưng của q trình oxy hóa polysaccharide bằng periodate bởi sự phân cắt cụ thể của liên kết C – C khi trên mỗi nguyên tử C này mang một nhóm OH trên các đơn vị đường. Sự phân tách này dẫn đến sự hình thành hai nhóm aldehyde trên đơn vị monosaccharide, tạo thành polysaccharid dialdehyde (Li, H. L., Wu, B., Mu, C. D., & Lin, W., 2011) và mất đi nhóm OH nên làm giảm độ tan của mủ trơm. Bên cạnh đó, nhóm acetyl trong mủ trơm vẫn cịn, nó cũng là nguyên nhân làm cho mủ
Nguyên thủy Thủy phân Oxy hóa Thủy phân - Oxy hóa 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 Độ t an ( %) Mẫu mủ trơm b a c bc
35
trơm ít hịa tan trong nước.Vì thế, độ tan của mủ trơm oxy hóa rất thấp so với mủ trơm ngun thủy.
Độ tan của mủ trơm thủy phân – oxy hóa cao hơn mủ trơm oxy hóa là do nó đã được thủy phân trước khi oxy hóa, nên nhóm acetyl đã được loại bỏ. Tuy nhiên độ tan của nó vẫn thấp hơn so với độ tan của mủ trôm ngun thủy là vì nhóm CHO được tạo thành từ q trình oxy hóa có thể phản ứng với nhóm OH cịn dư tạo thành acetal.
3.1.3. Độ nhớt của dung dịch mủ trơm
Hình 3. 3. Độ nhớt tương đối của mủ trơm sau khi biến tính
Quan sát hình 3.3, thấy độ nhớt của mủ trơm thủy phân cao nhất, tiếp đến là độ nhớt của mủ trôm nguyên thủy , mủ trôm thủy phân – oxy hóa và thấp nhất là oxy hóa.
0.025 0.050 0.075 0.100 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Độ nhớt tương đối Nồng độ mủ trôm (g/l)
Mủ trôm nguyên thủy Mủ trơm oxy hóa
36
Mủ trơm thủy phân có độ nhớt cao nhất là do nó có nhiều nhóm OH, các nhóm OH này liên kết chặt chẽ với nước trong dung dịch bằng các liên kết hydro làm tăng độ nhớt của mủ trơm. Ngồi ra bản chất của mủ trơm là một polysaccharide cao phân tử, nên các phân tử của nó sẽ liên kết chặt chẽ với nhau, điều này cũng là nguyên nhân làm tăng độ nhớt của mủ trôm. Độ nhớt của mủ trôm nguyên thủy thấp hơn mủ trôm thủy phân là do hàm lượng acetyl trong mủ trôm cao, hạn chế mủ trơm liên kết với nước. Cịn đối với mủ trơm oxy hóa và thủy phân – oxy hóa có độ nhớt thấp nhất là do q trình oxy hóa sẽ làm mất đi các nhóm OH ở 2 vị trí kề nhau để tạo thành CHO, làm giảm đi liên kết giữa mủ trôm với nước.
Xu hướng trên cũng đã được bàn luận trong một nghiên cứu của Y. Lopez-Franco và cộng