Quá trình thủy phân mủ trơm bằng kiềm được thực hiện theo phương pháp của Hanna Postulkova và cộng sự (2017). Cân 2 g bột mủ trôm, thêm vào 100 mL nước cất ở nhiệt độ phòng. Sau 24 h, thêm 33,3 mL NaOH 1 M vào hỗn hợp (tỷ lệ VNaOH : Vdd mủ trôm là 3 : 1), khuấy 30 phút. Sau đó sử dụng 56 mL HCl 1 M để trung hòa lượng NaOH dư sau khi hịa tan mủ trơm, khuấy 30 phút. Dùng 83 mL ethanol 99, 5% để kết tủa gum tan (tỷ lệ Vdd mủ trôm : Vethanol là 2 : 1), lọc thu lấy gum kết tủa và tiếp tục rửa gum kết tủa bằng ethanol 75% 2 lần. Gum kết tủa thu được, cắt nhỏ và sấy khô ở nhiệt độ 50oC trong 24 h. Các mẫu sấy khô được nghiền thành bột và bảo quản trong lọ thủy tinh.
Sấy 50oC, 24 h Lọc – rửa ethanol 75% ( Thủy phân Hydrat hóa 2 g mủ trơm Trung hịa Kết tủa ethanol 99.5% Lọc – rửa ethanol 99,5% Lọc – cắt nhỏ Nghiền Mủ trôm thủy phân 100 mL nước cất 33,3 mL NaOH 1M 56 mL HCl 1M 83 mL ethanol 99.5%
20
2.2.2.2. Oxy hóa mủ trơm bằng NaIO4
Hình 2. 3. Sơ đồ oxy hóa mủ trơm bằng NaIO4
Q trình oxy hóa mủ trơm được thực hiện tương tự theo phương pháp của Changdao Mu và cộng sự (2012) với một vài thay đổi cho phù hợp. Cân 1 g mủ trôm nguyên thủy và đã thủy phân, thêm vào 20 mL nước cất tạo dung dịch huyền phù ở điều kiện nhiệt độ phòng. Sau 24 h, cho 2 mL dung dịch NaIO4 (0,11 g/mL) vào và khuấy đều. Điều chỉnh độ pH của hỗn hợp về 3 bằng dung dịch H2SO4 1 M. Sau đó, q trình oxy hóa sẽ diễn ra trong tối tại nhiệt độ phòng trong 4 h. Dùng ethanol 99,5% để kết tủa sản phẩm (tỷ lệ Vdd mủ trôm : Vethanol là 1 : 3), lọc thu lấy kết tủa và rửa bằng ethanol 75% cho đến khi tất cả các hợp chất iod được loại bỏ. Sản phẩm được để sấy ở nhiệt độ 50oC cho đến khối lượng không đổi, nghiền thành bột và bảo quản trong lọ. Sấy 50oC Lọc – rửa kết tủa ethanol 75% Mủ trơm oxy hóa Nghiền
Oxy hóa bằng NaIO4 2 mL (0,11 g/mL)
Hydrat hóa 1 g mủ trơm
Điều chỉnh pH =3
Khuấy trong bóng tối 4 h, nhiệt độphòng
Kết tủa ethanol 99,5% 20 mL
21
2.2.2.3. Tạo màng
Hình 2. 4. Sơ đồ tạo màng mủ trơm – tinh bột
Khuấy từ, gia nhiệt 90oC, 10 phút
Phối trộn
Khuấy từ, gia nhiệt 90oC, 20 phút Đổ khuôn Mủ trôm, nước cất Tinh bột bắp, glycerol, nước cất Hydrat hóa Để khơ tự nhiên nhiệt độphịng, 48 h Bảo quản 80% RH, 48 h Màng
22
Quy trình tạo màng được thực hiện theo phương pháp của Anjum Nawab và cộng sự (2017), Farahnaky và cộng sự (2013) với một vài thay đổi (Anjum Nawab, Feroz Alam, Muhammad Abdul Haq., 2017) và (Farahnaky, A., Saberi, B., & Majzoobi, M. , 2013). Cân 0,1 g mủ trơm đã được thủy phân và oxy hóa với tỷ lệ 5% so với tổng khối lượng tinh bột bắp, ngâm trong 20 mL nước cất cho tan hoàn toàn. Tiếp theo, cân 2 g tinh bột bắp, thêm vào 40 mL nước cất tạo dung dịch huyền phù có nồng độ 5% (w/v). Thêm vào hỗn hợp 0.6 g glycerol (30% khối lượng tinh bột bắp, w/w) và 0,02 g cinnamaldehyde (1% khối lượng tinh bột bắp, w/w, đối với các màng kết hợp cinnamaldehyde). Khi khảo sát khả năng chống oxy hóa, khả năng thấm ẩm và khả năng kháng vi khuẩn, nấm mốc của màng thì sử dụng 0,1 g cinnamaldehyde (5% khối lượng tinh bột bắp, w/w). Khuấy từ và gia nhiệt hỗn hợp ở 90oC trong 20 phút. Dung dịch chuyển từ màu trắng đục sang trong dần. Sau đó, cho dung dịch mủ trơm đã hydrat hóa vào hỗn hợp, tiếp tục khuấy thêm 10 phút và đổ vào khn (đường kính 17,78 cm), để khơ ở nhiệt độ phòng trong 48 h. Các màng được lấy cẩn thận ra khỏi khuôn và bảo quản trong mơi trường độ ẩm khơng khí 80% RH ( mơi trường chứa dung dịch NaCl bão hịa) trong ít nhất 48 h trước khi tiến hành khảo sát các tính chất màng.
2.3. Nội dung và phương pháp phân tích
2.3.1. Các tính chất mủ trơm trước và sau khi biến tính 2.3.1.1. Phổ FTIR 2.3.1.1. Phổ FTIR
Phổ hồng ngoại được ghi lại bằng thiết bị quang phổ Fourier transform infrared spectrometer (FTIR - 4700). Các mẫu được sấy khô ở 50oC, được nghiền thành bột, đặt và ép chặt lên đế ATR bằng kim cương sau đó quét phổ IR. Phạm vi hấp thụ được đo từ 400 - 4000 cm-1 với độ phân giải 4 cm-1.
2.3.1.2. Độ tan
Độ tan của mủ trôm được xác định theo Zuanon và công sự (2013) với một vài thay đổi. Ngâm 0,2 g mủ trôm với 100 mL nước cất trong 24 h, ở nhiệt độ phòng. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 3000 rpm trong 15 phút, thu lấy dung dịch trong. Sau đó đem cân rồi sấy khơ dung dịch này trong 24 h, ở 105°C, cân xác định khối lượng chất rắn, chính là mủ trơm tan. Phép đo được lặp lại 3 lần cho mủ trôm nguyên thủy, thủy phân, oxy hóa và thủy phân – oxy hóa.
Độ tan của mủ trôm được xác định theo công thức: 𝑚𝑐𝑟
23
Trong đó:
𝑚𝑐𝑟: khối lượng chất rắn sau khi sấy (g)
𝑚𝑑𝑑: khối lượng dung môi trước khi sấy (g)
2.3.1.3. Độ nhớt tương đối
Lấy lần lượt 0,0025 g; 0,0050 g; 0,0075 g; 0,0100 g mủ trôm đã nghiền mịn vào 100 mL nước cất ngâm trong 24 h, ở nhiệt độ phòng thu được các dung dịch ở 4 nồng độ khác nhau 0,025 g/L; 0,050 g/L; 0,075 g/L; 0,100 g/L. Tiến hành đo thời gian mỗi dung dịch và nước cất chảy qua nhớt kế mao dẫn và cuối cùng xác định độ nhớt tương đối (η) bằng nhớt kế mao dẫn Ostwald có Ø = 0.3 mm. Thực hiện đo 3 lần tại mỗi nồng độ.
Độ nhớt tương đối được xác định theo cơng thức:
ηr = 𝑡𝑑𝑑
𝑡𝑛𝑐
Trong đó:
𝑡𝑑𝑑: thời gian dung dịch chảy qua nhớt kế (s) 𝑡𝑛𝑐: thời gian nước cất chảy qua nhớt kế (s)
2.3.1.4. Hàm lượng nhóm carbonyl của bột mủ trơm
Hàm lượng nhóm carbonyl của bột mủ trơm được xác định theo phương pháp của Jiugao Yu (2010). Cân 0,2 g các mẫu bột mủ trơm oxy hóa hoặc thủy phân – oxy hóa (khơ) cho vào cốc 250 mL và thêm dung dịch hydroxylamine hydrochloric (25 mL; 0,25 M), dùng đũa khuấy đều. Thêm từ từ dung dịch NaOH 0,1 M đến khi pH của dung dịch bằng 5 ( sử dụng máy đo pH). Bỏ các cốc vào bể điều nhiệt 50oC và khuấy dung dịch bằng đũa khuấy. Cứ sau 2 tiếng đo pH mẫu một lần, duy trì pH mẫu bằng 5, bằng cách thêm dung dịch NaOH 0.1M. Ghi nhận lượng NaOH đã sử dụng. Dùng 0,2 g bột mủ trôm nguyên thủy làm tương tự theo cách trên để làm mẫu đối chứng.
Phần trăm nhóm CHO được xác định theo cơng thức sau: 29 ×0,1 ×(𝑉𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒−𝑉𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙)
0,2 ×1000 × 100 (%)
Trong đó:
Vsample: thể tích dung dịch NaOH sử dụng chuẩn độ mẫu mủ trơm bị biến tính (mL) Vcontrol: thể tích dung dịch NaOH sử dụng để chuẩn độ mẫu mủ trôm nguyên thủy (mL)
24
2.3.1.5. Độ hút ẩm của bột
Độ hút ẩm của bột đo theo phương pháp của Cai, Y.-Z., & Corke, H. (2000). Cân 0,5 g các mẫu bột mủ trơm ngun thủy, thủy phân , oxy hóa, thủy phân-oxy hóa (khơ) cho vào các cốc nhựa và trải đều. Sau đó cân cả khối lượng của bột và cốc nhựa . Các cốc được đặt trong môi trường với độ ẩm tương đối khoảng 80% RH ở nhiệt độ phòng (Bertuzzi, 2007). Tiến hành cân khối lượng các cốc 1 h / 1 lần trong 48 h. Độ hút ẩm của bột được xác định từ sự tăng khối lượng của cốc sau 1h. Dựng đồ thị độ hút ẩm của bột tăng theo thời gian.
Độ hút ẩm của bột tại thời điểm t được tính theo cơng thức: 𝑚𝑡−𝑚0
𝑚0 × 100 (%) Trong đó:
mt là khối lượng của bột mủ trôm sau thời điểm t (g) mo là khối lượng của bột mủ trôm ban đầu (g)
2.3.2. Các tính chất màng mủ trơm – tinh bột 2.3.2.1. Khả năng kháng đâm xuyên 2.3.2.1. Khả năng kháng đâm xuyên
Phép đo thuộc tính cơ học của màng về khả năng kháng đâm xuyên được thực hiện bằng thiết bị đo kết cấu CT3 Texture Analyzer (Brookfield, Mỹ). Trước khi tiến hành các phép đo, các màng đã được bảo quản ở nhiệt độ phòng và độ ẩm tương đối 80% RH trong 48 h.
Khả năng chống đâm xuyên là khả năng chống chịu lực tác động vng góc với màng. Đối với nghiên cứu này, chúng tôi xác định khả năng kháng đâm xuyên theo phương pháp của Saberi và cộng sự, năm 2016. Cắt các màng với kích thước 40×40 mm. Cố định màng bằng hai tấm kẹp, có tâm khuyết trịn ở giữa (đường kính D = 7,8 mm). Sử dụng đầu dị TA-MTP 4R (đường kính d = 4 mm). Thiết lập tốc độ di chuyển của đầu dò là 1.00 mm/s. Lắp đặt đầu dò di chuyển vng góc với màng và đâm thủng màng qua tâm khuyết giữa hai tấm kẹp. Ghi nhận đường cong trở lực - độ biến dạng trong quá trình đo. Các giá trị lực đâm xuyên tối đa (g), độ biến dạng (mm) tại thời điểm màng bị thủng được ghi lại để tính ứng suất đâm xuyên (puncture strength) và độ giãn trước khi thủng (mm), độ cứng của màng. Mỗi mẫu thực hiện lập lại 3 lần. Ứng suất đâm xun được tính theo cơng thức (M. Preis, K. Knop, J. Breitkreutz., 2014):
𝑃 =𝐹
𝐴 (𝑀𝑃𝑎)
25
F là lực đâm xuyên lớn nhất (N)
𝐴 = 𝜋 × (𝑑
2)2 = 12,56 mm2 là diện tích vùng đâm xuyên, d = 4 mm
Hình 2. 5. Thiết bị đo khả năng kháng đâm xuyên 2.3.2.2. Khả năng kháng kéo giãn 2.3.2.2. Khả năng kháng kéo giãn
Phép đo thuộc tính cơ học của màng về khả năng kháng kéo giãn được thực hiện bằng thiết bị đo kết cấu CT3 Texture Analyzer (Brookfield, Mỹ). Trước khi tiến hành các phép đo, các màng đã được bảo quản ở nhiệt độ phòng (30oC) và độ ẩm tương đối 80% RH trong 48 h.
Cắt các mẫu màng với kích thước 120 × 15 mm. Tiến hành thiết lập các thơng số sau: lực kích hoạt (trigger load) 1 g, tốc độ kéo (test speed) 1,00 mm.s. Sau đó dán cố định hai đầu mẫu màng vào 2 trục của thiết bị có Ø = 17,8 mm. Khoảng cách ban đầu giữa 2 trục, tính từ tâm của 2 trục là 45 mm. Tiến hành cho máy đo chạy, trục trên bắt đầu đi lên kéo màng giãn dài tới khi đứt hồn tồn thì dừng. Mỗi mẫu được đo lặp lại 3 lần.
Độ giãn dài của màng được tính theo cơng thức (Standard & ISO, 1996):
𝜀 =∆𝐿
𝐿0 × 100 (%)
Trong đó:
Ɛ: là giá trị độ biến dạng của màng khi đứt được tính bằng tỷ lệ phần trăm (%) L0: là chiều dài ban đầu của mẫu (mm) (L0 = 45 mm)
26
ΔL: là chiều dài tăng thêm của mẫu (mm)
Hình 2. 6. Thiết bị đo khả năng kháng kéo giãn 2.3.2.3. Độ ẩm, khả năng hấp thụ nước, khả năng hòa tan 2.3.2.3. Độ ẩm, khả năng hấp thụ nước, khả năng hịa tan
Chúng tơi đã thực hiện nghiên cứu này dựa theo phương pháp của Thi Luyen Cao (2019b) (Cao, T. L., & Song, K. B. , 2019b). Tuy nhiên vẫn có một vài thay đổi nhỏ trong thí nghiệm nhằm tạo điều kiện thuận lợi và phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm sẵn có.
Cắt các màng với kích thước 30×30 mm và đem sấy khơ các mẫu màng (W0) ở 105°C trong 24 h, sau đó cân xác định khối lượng sau sấy (W1). Sau khi sấy xong ngâm các màng trong 20 mL nước cất ở nhiệt độ phịng. Sau 24 h, màng được làm khơ bề mặt bằng khăn giấy sạch và được cân lại (W2). Tiếp tục đem sấy các mẫu màng đã được làm khô bớt nước trong 24 h ở 105°C, sau khi sấy xong cân các màng (W3). Mỗi mẫu được đo lặp lại 3 lần.
Độ ẩm (Moisture content, MC) được xác định theo công thức sau:
MC =𝑊0− 𝑊1
𝑊0 × 100 (%)
Khả năng hấp thụ nước (water uptake, WU) được xác định theo cơng thức sau:
WU =𝑊2− 𝑊3
𝑊3 × 100 (%)
27 Ws =𝑊3 − 𝑊1
𝑊1 × 100 (%)
Trong đó:
W0 là khối lượng màng ban đầu (g) W1 là khối lượng màng sau khi sấy (g)
W2 là khối lượng màng sau khi ngâm nước (g) W3 là khối lượng màng sấy sau khi ngâm (g)
2.3.2.4. Khả năng thấm ẩm
Khả năng thấm ẩm (Water vapor permeability-WVP) của màng được xác định theo phương pháp ASTM E-96 và có một vài thay đổi (Standard & ISO, 1996).Phương pháp được thực hiện bằng cách chuẩn bị các cốc thủy tinh có đường kính trong 40 mm, đường kính ngồi 50 mm và chiều cao 65 mm. Bỏ silicagel đã sấy khô vào cốc để tạo độ ẩm tương đối 0% bên trong cốc. Các mẫu màng được gắn lên miệng cốc và dùng nắp gắn chặt lên. Trên nắp đã được khoét một lỗ trịn có đường kính 40 mm. Sau đó đặt trong mơi trường với độ ẩm tương đối khoảng 80% RH ở nhiệt độ phòng. Tiến hành cân khối lượng các cốc 1 h/1 lần trong 48 h. Khả năng thấm ẩm được xác định từ sự tăng khối lượng của cốc sau 1h. Dựng đồ thị dựa trên hồi quy tuyến tính (r2 > 0,99) từ những dữ liệu về khối lượng cốc tăng lên và thời gian, để xác định độ dốc của đường thẳng. Tốc độ truyền ẩm (Water vapor transmission rate-WVTR) được xác định bằng cách chia độ dốc K (g/h) cho diện tích truyền ẩm A (m2). Khả năng thấm ẩm WVP được xác định theo công thức (Babak Ghanbarzadeha, Hadi Almasia, Ali A. Entezamib., 2011):
WVP được xác định bởi công thức sau:
WVP = WVTR
𝑃 × (𝑅𝐻2− 𝑅𝐻1)× 𝑋 (𝑔/ 𝑃𝑎. 𝑚. 𝑠)
Trong đó: 𝑊𝑉𝑇𝑅 = 𝐾
𝐴 (A = 4 m2)
P là áp suất hơi nước bão hòa (Pa) ở nhiệt độ tiến hành thí nghiệm, P = 3167Pa (Babak Ghanbarzadeha, Hadi Almasia, Ali A. Entezamib., 2011)
RH1 là độ ẩm bên ngoài cốc (80% RH) và RH2 là độ ẩm bên trong cốc (0%) X là độ dày của màng (m)
28
Hình 2. 7. Cốc sử dụng để đo khả năng thấm ẩm 2.3.2.5. Khả năng chống oxy hóa 2.3.2.5. Khả năng chống oxy hóa
Khả năng chống oxy hóa của màng được thực hiện theo phương pháp đo hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của Yichao Ma và cộng sự (2017) với một vài thay đổi (Yichao Ma, Li, L., & Wang, Y. , 2017).
Hòa tan 2,5 mg DPPH tromg 100 mL ethanol 99,5% để chuẩn bị dung dịch DPPH 0,063 mM. Cắt 0,4 g mỗi mẫu màng chứa cinnamaldehyde cho vào các cuvet thủy tinh chứa 3,0 mL DPPH 0,063 mM. Một cuvet chứa mẫu đối chứng âm bao gồm 3,0 mL dung dịch DPPH 0,063 mM và 200 µL ethanol 99,5%. Cứ mỗi 1 h, đo theo thời gian độ hấp thụ của các cuvet chứa mẫu cần đo và cuvet đối chứng. Mỗi cuvet được đo với một blank riêng. Cuvet đối chứng với mẫu blank là 3,2 mL ethanol 99,5%. Cuvet 4 mẫu màng cần đo với 4 mẫu blank là 0,4 g màng và 3,0 mL ethanol 99,5%.
Đo độ hấp thụ các dung dịch ở bước sóng 515 nm trong 24 h. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Phần trăm độ hấp thụ DPPH giảm tại thời điểm t được tính theo cơng thức: % độ hấp thụ DPPH giảm = (𝐴0 − 𝐴𝑡 )−(𝐴0 Đ𝐶 − 𝐴𝑡 Đ𝐶)
𝐴0 × 100 (%)
Trong đó:
A0: độ hấp thụ của mẫu màng tại thời điểm t0 At: độ hấp thụ của mẫu màng tại thời điểm t
A0 ĐC: độ hấp thụ của mẫu đối chứng tại thời điểm t0 At ĐC: độ hấp thụ của mẫu đối chứng tại thời điểm t
29
2.3.2.6. Phổ hấp thụ UV – Vis và độ truyền quang
Độ trong suốt của màng được xác định bằng cách đo phần trăm ánh sáng truyền qua bằng thiết bị đo quang phổ UV-Vis (UH-3500 Hitachi). Chuẩn bị các mẫu màng có kích thước 12×40 mm. Đặt trực tiếp các màng vào khe để cuvet trong máy quang phổ, vng góc với chùm sáng. Phép đo được thực hiện bằng cách sử dụng khơng khí làm tham chiếu. Phổ của mỗi màng thu được ở bước sóng 200 – 1100 nm. Xác định giá trị trung bình phần trăm ánh sáng truyền qua tại ba vùng bước sóng: vùng UV 200 – 380 nm, vùng ánh sáng thấy 380 – 700 nm, vùng hồng ngoại 700 -1100nm.
2.3.2.7. Xác định độ dày của màng
Độ dày của các mẫu màng được đo bằng thước kẹp điện tử sau khi bảo quản ở mơi trường chứa NaCl bão hịa trong vịng 24 h. Đo 10 vị trí khác nhau của màng, tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn. Độ chính xác của thước là ± 0,01 mm.
2.3.2.8. Khả năng kháng nấm mốc
Chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu này dựa theo phương pháp của Mari Pau Balaguer (2014) và U.K. Aruna Nair (2020) (Balaguer, M. P., Fajardo, P., Gartner., 2014) và ( Nair, U. A., Selvam, S. P., Dharini, V., Nambiar, R. B., 2020). Tuy nhiên vẫn có một vài thay đổi nhỏ trong thí nghiệm nhằm tạo điều kiện thuận lợi và phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm sẵn có.
Chuẩn bị mơi trường nuôi cấy nấm mốc (2% agar, 2% Nutrient Broth (NB), 8 ppm thuốc