Phương pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát hiện năm 1985. Nhờ enzyme DNA polymerase xúc tác, trên các mạch khuôn DNA tổng hợp nên các mạch đơn mới. Các mạch đơn mới được tổng hợp lại và được sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp mạch mới của chu kỳ tiếp theo. Sự tổng hợp mạch đơn mới cần có sự tham gia của DNA mồi tạo các nhóm 3’OH tự do. Các nucleotide được gắn ở vị trí nhóm OH kéo dài tạo thành mạch đơn mới.
Thành phần của phản ứng PCR cho một chủng và một mồi (20 µl)
DNTPs 2 µl
Buffer 3 µl
Forward Primer (mồi xuôi) 1 µl Revert Primer (mồi ngược) 1 µl DNA Template (DNA khuôn) 2 µl
Taq polymerase 1 µl
Nước khử ion vô trùng 10 µl
a. Chương trình chạy PCR cho phản ứng khuyếch đại gen cry4A:
1. Biến tính ban đầu ở nhiệt độ 94oC trong 3 phút. DNA khuôn bị biến tính. Mục đích là phá vỡ các liên kết hydro giữa hai mạch đơn và để hai mạch đơn tách nhau ra.
2. Phản ứng tiếp diễn theo chu kỳ, mỗi chu kỳ có các bước sau: - Biến tính ở nhiệt độ 94oC trong khoảng thời gian là 1 phút.
- Gắn mồi ở nhiệt độ 56oC trong 1 phút. Đoạn mồi gắn vào DNA khuôn sợi đơn theo nguyên tắc bổ sung giữa các bazơ nitơ.
- Tổng hợp DNA ở nhiệt độ 72oC trong thời gian 1 phút. Enzyme Taq DNA polymerase hoạt động và tổng hợp DNA trên những đoạn có mồi gắn vào.
3. Ổn định ở nhiệt độ 72oC trong vòng 10 phút. Các đoạn DNA ở các chu kỳ trước nếu chưa được tổng hợp xong sẽ được tổng hợp nốt.
4. Chấm dứt phản ứng và giữ ở nhiệt độ 4oC để bảo quản.
b. Chương trình chạy PCR cho phản ứng khuyếch đại gen cry4B:
1. Biến tính DNA ở nhiệt độ 95oC trong 2 phút. 2. Tổng hợp (30 chu kỳ)
- Biến tính ở 95oC trong 1 phút - Gắn mồi ở 50oC trong 1 phút - Kéo dài chuỗi ở 72oC trong 1 phút 3. Tổng hợp bổ sung 72oC trong 10 phút 4. Bảo quản 4oC