Lựa chọn môi trường thích hợp cho sản xuất chế phẩm từ chủng TB1.5. Sinh khối (CFU) sau 3 ngày lên men với 3 loại môi trường khác nhau được trình bày ở bảng 3.5:
Bảng 3.5. Lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của chủng TB1.5
Môi trường Số lượng bào tử/ml
Môi trường 1 15 × 107
Môi trường 2 20,5 × 107
Môi trường 3 8 × 107
Từ Bảng 3.5 cho thấy môi trường số 2 (môi trường lên men) đạt kết quả tốt nhất cho nuôi cấy chủng TB1.5.
Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm dạng bánh tan chậm:
Phối trộn môi trường: Môi trường nuôi cấy gồm có: 30g bột đậu tương, 10g
(NH4)2SO4, 1l nước cất, 1ml vi lượng, pH = 7. Đậu tương được hòa vào với nước lạnh, đun sôi, khuấy đều trong 5 phút rồi đem lọc qua rây lọc bỏ cặn, bổ sung thêm các thành phần khác rồi khử trùng.
Phối trộn môi trường
Khử trùng (1210, 30 phút)
Lên men (280C, 72 giờ)
Li tâm hoặc kết tủa (4000 v/p, 15 phút)
Trộn đều và ngâm bão hòa với cặn kết tủa
Đóng gói
Gia nhiệt bằng hơi nước
Làm nguội
Nhân giống Cấp giống
Thu cặn
Lõi ngô và bọt xốp
Hình 3.7. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất thuốc sinh học trừ muỗi dạng bánh tan chậm
Gia nhiệt khử trùng: môi trường được khử trùng bằng hơi nước bão hòa có
nhiệt độ 1210C, ở áp suất 1 atmosphere, trong thời gian 30 phút.
Làm nguội: môi trường được làm nguội bằng cách để nguội tự nhiên hoặc
dùng nước làm mát đến nhiệt độ thường.
Chuẩn bị giống: chủng giống được cấy từ ống thạch nghiêng chứa môi
trường MPA vào bình tam chứa môi trường LB, lắc qua đêm 200 v/p ở 280C.
Cấp giống: tỷ lệ cấp giống 5% trong điều kiện vô trùng.
Nuôi cấy: chế độ nuôi cấy duy trì pH 7-7,5, nhiệt độ 280C, duy trì độ hòa tan oxy trên 90%, kết thúc nuôi cấy sau 72 giờ sau khi tinh thể được giải phóng khoảng 95%.
Ly tâm hoặc kết tủa: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Kết tủa: sinh khối và dịch nuôi cấy được kết tủa bằng cách bổ sung chất
trợ lắng diatomite 0,5%, ly tâm 3000-4000 v/ph, bỏ dịch rồi thêm một lượng bằng thể tích cặn thu được dung dịch lactose 4-6%, hòa tan cặn trong 30 phút bằng cách khuấy đều, thêm gấp 4 lần thể tích acetone, tiếp tục khuấy liên tục cho hoàn toàn đồng nhất, sau đó để lắng 10 phút để kết tủa rồi lọc qua màng lọc, bỏ dịch. Rửa cặn bằng lượng nhỏ acetone rồi để khô ở nhiệt độ phòng hoặc dùng máy sấy hút chân không
+ Ly tâm: để thu hồi chế phẩm bằng phương pháp ly tâm, chế độ ly tâm
phù hợp cho dịch sau lên men là 4000 v/p trong thời gian 15 phút, thu cặn bỏ dịch.
Chất mang:
- Lõi ngô cắt tròn dày 2-3 mm. Khử trùng khô ở 1000C trong 2 giờ.
- Bọt xốp cắt miếng hình khối có kích thước 3×2×2 cm. Ngâm trong dung dịch HNO3 1M xử lý ở nhiệt độ 90 – 1000C trong 30 phút. Sau đó, rửa lại bằng nước sạch và ngâm trong acetone 24 giờ, vớt ra rửa kỹ lại bằng nước sạch, mang phơi khô. Khử trùng ở 1000C trong 1 giờ.
Trộn đều và ngâm bão hòa với cặn kết tủa:
Cặn kết tủa hòa tan với 1,5 ml nước khử (cho 10 bánh lõi ngô) và 3ml nước khử (cho 10 miếng bọt xốp). Sau đó, trộn đều bánh lõi ngô và bọt xốp đã cắt với dịch đậm đặc sinh khối bào tử và tinh thể độc tố với tỷ lệ 150µl dịch sinh khối/1 bánh lõi ngô và 300µl dịch sinh khối/1 miếng bọt xốp, trong thời gian cần thiết để xảy ra sự thấm hút bão hòa vào lõi ngô và bọt xốp
Sấy khô: Sản phẩm được sấy khô ở nhiệt độ 450C, có thổi thông gió đến khô.
Đóng gói: Sản phẩm được đóng gói trong bao nilon và dán nhãn, bảo
quản ở nơi mát, tránh ánh sáng trực tiếp.
Hình 3.8. Hình ảnh chế phẩm TB1.5 và chất mang
a. Chế phẩm và bọt xốp sau khi ngâm bão hòa b. Chế phẩm và lõi ngô sau khi ngâm bão hòa
Kết quả thành lập công thức chế phẩm
Để thành lập được các công thức chế phẩm phù hợp với điều kiện địa lý và
sinh thái Việt Nam, yêu cầu của chế phẩm phải là dạng tan chậm trong nước và có hiệu quả diệt bọ gậy kéo dài.
Theo sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất thuốc sinh học diệt muỗi (Hình 3.7). Các công thức được thành lập gồm các thành phần nêu trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Thành phần công thức chế phẩm dạng bánh tan chậm
Công thức Thành phần Ưu điểm Hạn chế
CT1 Lõi ngô Thành phần là cellulose, nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền, chế phẩm tan chậm trong nước, lõi ngô phân hủy sau một thời gian nên an toàn với môi trường. Khả năng thấm hút chế phẩm chậm CT2 Bọt xốp Thành phần là poliuretano, khả năng thấm hút chế phẩm nhanh. Nguyên liệu ít sẵn có, đắt tiền, bọt xốp tồn lưu gây ảnh hưởng xấu đến môi trường .
Hoạt lực diệt bọ gậy muỗi Culex quinquefasciatus của các công thức được nêu trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Hoạt lực diệt bọ gậy muỗi Culex quinquefasciatus của các công thức chế phẩm dạng bánh
Công thức Tỷ lệ chết (%)
6 giờ 12 giờ 24 giờ
Thí nghiệm CT1 76,6 86,6 96,6
CT2 80 90 100
Đối chứng Nước 0 0 0
Từ bảng 3.7 cho thấy công thức chế phẩm làm từ bọt xốp cho kết quả cao hơn chế phẩm làm từ lõi ngô. Tuy nhiên từ bảng phân tích ưu nhược điểm của 2 loại công thức trên (Bảng 3.6), chúng tôi đã lựa chọn sử dụng lõi ngô làm nguyên liệu cho sản xuất chế phẩm sinh học diệt ấu trùng muỗi. Tuy nhiên trong
trường hợp phát sinh thành dịch, số lượng ổ muỗi nhiều, có thể dùng chế phẩm làm từ bọt xốp để dập dịch. Sau đó có thể thu hồi bọt xốp nổi trên mặt nước. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thành phần chế phẩm bánh lõi ngô tan chậm: lõi ngô, vi khuẩn Bacillus
thuringiensis subsp. israelensis (TB1.5).