Các mẫu đất được thu thập bằng cách sử dụng dao vô trùng cạo bề mặt đất lấy 50 g ở độ sâu 3-5 cm, cho vào túi nilon dán kín [4].
Ta cân 1g đất cho vào bình tam giác 250ml chứa 99ml nước cất vô trùng, lắc ở 200 vòng/phút trong 30 phút. Lấy dịch ra cho vào ống eppendorf xử lý nhiệt ở 700C trong 10 phút. Dịch đã xử lý pha loãng với nước cất vô trùng ở các nồng độ 10-2, 10-3. Ở mỗi nồng độ pha loãng, hút 100µl dịch pha loãng trang lên đĩa petri chứa môi trường MPA, với mỗi nồng độ cấy 2 đĩa, nuôi trong 72 giờ ở 280C.
Sau 72 giờ nuôi cấy chọn những khuẩn lạc riêng rẽ mọc trên môi trường và làm tiêu bản. Quan sát hình thái tế bào, bào tử, tinh thể trên kính hiển vi đối pha hoặc nhuộm bằng thuốc nhuộm tinh thể, quan sát ở vật kính dầu. Lựa chọn những khuẩn lạc của vi khuẩn Bt sinh tinh thể, sau đó được cấy và quan sát lại.
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính diệt muỗi của các chủng Bacillus
thuringiensis (Bt)
* Định lượng mật độ bào tử, tinh thể
Chủng Bt phân lập được đem cấy thảm trên đĩa peptri chứa môi trường MPA, ủ ở 280C sau 72 giờ thu sinh khối vào ống effpendorf 1,5ml chứa 1ml nước cất vô trùng để bảo quản.Lấy 150µl dịch sinh khối này sang ống efpendorf khác rồi đem đi xử lý nhiệt ở 700C trong 10 phút để loại bỏ tế bào sinh dưỡng. Sau đó đem pha loãng đến các nồng độ 10-7 và 10-8. Hút 100µl dịch pha loãng ở mỗi nồng độ, trang vào 2 đĩa chứa môi trường MPA. Nuôi trong tủ ấm 280C sau
24 giờ đem đếm số khuẩn lạc mọc trên từng đĩa ở mỗi nồng độ. Từ đó số lượng bào tử được tính theo công thức:
CFU = n.a.10
CFU (Colony Forming Unit): Đơn vị hình thành khuẩn lạc
n: Số khuẩn lạc trung bình tạo thành trong 100 µl dịch pha loãng a: Nồng độ pha loãng
* Thử hoạt tính sinh học trên đối tượng ấu trùng muỗi
Ấu trùng muỗi thử nghiệm: Culex quinquefasciatus.
Vệ sinh sạch sẽ các cốc thử nghiệm. Pha loãng các chủng Bt phân lập ở
nồng độ 103 và 105 bào tử/ml cho 10 ấu trùng muỗi tuổi 3 vào cốc chứa 100 ml dịch pha loãng, mỗi nồng độ 3 cốc thử nghiệm. Các cốc đối chứng âm (-) chứa nước cất vô trùng, các cốc đối chứng dương (+) chứa chủng Bti chuẩn. để các mẫu thử nghiệm ở nhiệt độ 20 – 250C và đặt ở nơi thoáng mát tránh ánh nắng.
Kiểm tra ấu trùng muỗi chết sau 4, 6, 8, 12 giờ thử nghiệm. Tỷ lệ ấu trùng muỗi chết tính theo công thức Abbott:
A = (C – T).100/C
A: % ấu trùng muỗi chết
C: Số ấu trùng muỗi còn sống ở mẫu đối chứng T: Số ấu trùng muỗi còn sống ở mẫu thí nghiệm