* Chuẩn bị mẫu protein tinh thể hòa tan:
Các chủng Bt có hoạt tính diệt ấu trùng muỗi cao mang cả 2 đoạn gene
cry4A và cry4B đã được phân lập đem nuôi lắc qua đêm 200 vòng/phút ở 28 oC trong môi trường LB. Cấy chuyển 5% dịch nuôi sang bình tam giác 500ml chứa 100ml môi trường LB, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 280C trong 4 ngày. Dịch lên
men được ly tâm ở 10.000 vòng trong 10 phút ở 40C, thu cặn. Tủa này gồm hỗn hợp tất cả bào tử, protein tinh thể diệt côn trùng, mảnh tế bào và các thể rắn được hòa tan. Để xác định nồng độ protein tinh thể diệt côn trùng (nội độc tố) bằng cách rửa cặn 3 lần với dung dịch 0,14M NaCl 0,01% Triton X-100 nhằm loại bỏ các protein hòa tan và protease, nó kết chặt gây ảnh hưởng đến độ tinh sạch của protein tinh thể sau khi ly tâm. Tủa có chứa các protein tinh thể diệt côn trùng được hòa tan với NaOH 0,05M (pH = 12,5) lắc trong 3 giờ và khuấy cho tan kết tủa. Dịch huyền phù được ly tâm ở 10.000 vòng trong 10 phút ở 40C. Loại bỏ cặn có chứa bào tử, mảnh tế bào và các thể rắn được hòa tan. Thu dịch nổi có chứa các protein tinh thể diệt côn trùng hòa tan trong kiềm. Xác định nồng độ nội độc tố bằng phương pháp Bradford sử dụng albumin huyết thanh bò như protein chuẩn [15].
*Xác định hàm lượng protein tinh thể theo phương pháp Bradford
Bước 1: chuẩn bị dung dịch cho việc định lượng protein. + Pha dung dịch màu cho định lượng protein:
coomassi – Brillian – Bluesewan-35050 (G250) 40 mg
Ethanol 95% 20 ml
H3PO4 85% 40 ml
H2O 40 ml
+ Dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin): 1mg/ml
Bước 2: Dựng đường cong chuẩn biểu diễn nồng độ protein chuẩn (BSA). + Dung dịch mẫu bao gồm: dung dịch BSA, nước và dung dịch màu theo thể tích lần lượt như bảng sau (làm lặp lại 3 lần):
dd BSA (µl)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
nước (µl) 850 848 846 844 842 840 838 836 834 832 830
(µl) Tổng (µl) 100 0 100 0 100 0 100 0 100 0 100 0 100 0 100 0 100 0 100 0 1000
Dung dịch trên lắc đều, để 5 phút cho phản ứng xảy ra ở nhiệt độ phòng (dung dịch mẫu lượng BSA = 0 làm Blank). Sau đó đo độ hấp phụ quang học (OD) ở bước sóng 595 nm. Dựng đồ thị biểu diễn hàm lượng BSA tương ứng với giá trị OD đo được ở 595 nm theo đồ thị sau:
Hình 2.2. Biểu đồ biểu diễn nồng độ protein chuẩn (BSA)
Đường cong chuẩn này được sử dụng để xác định hàm lượng protein trong các mẫu đã chuẩn bị.
Bước 3: Định lượng protein của các mẫu dung dich protein tinh thể hòa tan được chuẩn bị:
Dung dịch mẫu có chứa: 150 µl dung dịch màu, 830 µl nước và 20 µl dịch protein tinh thể đã chuẩn bị ở trên rồi lắc đều, để 5 phút trong nhiệt độ phòng và đo OD ở bước sóng 595 nm. Giá trị OD được thế vào y của phương trình tuyến tính của đồ thị trên có giá trị x là nồng độ protein tinh thể có trong 20 µl dich. Công thức xác đinh hàm lượng protein có trong 1ml dịch ban đầu là.
M (mg) = v.a
a: độ pha loãng dung dịch
*Tiến hành thử hoạt tính trên muỗi
Ấu trùng muỗi thử nghiệm: Culex quinquefasciatus.
Vệ sinh sạch sẽ các cốc thử nghiệm. Pha loãng dung dịch protein của các chủng Bt phân lập có hoạt tính cao như đã trình bày trong thí nghiệm trước và mang cả 2 gen cry4A và cry4B ở nồng độ từ 0, 100, 200, 300, 400, 500 µg protein tinh thể/ml. Phương pháp thử nghiệm theo mô tả ở thí nghiệm trước. Tỷ lệ tử vong trên 50%. Nồng độ gây chết một nửa (LC50) được xác định theo phân tích probit. Các số liệu được thể hiện dưới dạng số học trung bình ± sai số chuẩn. Phân tích thống kê liên quan đến một chiều phân tích phương sai (ANOVA) tiếp theo là thử nghiệm so sánh nhiều cặp của Tukey. Mức ý nghĩa được thể hiện như P-giá trị nhỏ hơn 0,05.