Chuẩn bị mẫu thử và đậm độ pha loãng ban đầu
-Sản phẩm dạng lỏng: Thường dùng mẫu nguyên cho đậm độ nuôi cấy ban
đầu. Hút 25ml mẫu thử cho vào BÌNH 225ml dung dịch đệm pepton để có đậm độ pha lỗng 10-1, tương tự với các đậm độ pha loãng tiếp theo tuỳ từng mẫu thử.
- Sản phẩm dạng khác: Cân 25g mẫu thử đã đồng nhất cho vào bình có
225ml nước đệm pepton. Từ đậm độ pha loãng ban đầu này (10-1) pha loãng các đậm độ tiếp theo tuỳ từng mẫu thử.
Cấy mẫu
- Sản phẩm dạng lỏng: cho vào 2 đĩa petri, mỗi đĩa 1ml mẫu nguyên. Tiến hành tương tự nếu cần có các đậm độ pha lỗng tiếp theo, mỗi đậm độ cấy hai đĩa.
- Sản phẩm dạng khác: cho vào 2 đĩa petri, mỗi đĩa 1ml đậm độ pha loãng ban đầu (10-1), tương tự với các đậm độ pha loãng tiếp theo, mỗi đậm độ cấy hai đĩa.
Mơn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 Rót vào mỗi đĩa 10-15 ml thạch TSC( Đã đun chảy và để nguội tới 450), trộn đều bằng cách xoay nhẹ đĩa theo hai chiều trái, phải. Để đông tự nhiên, sau đó phủ lên trên bề mặt thạch của mỗi đĩa 10ml thạch màng TSC. Để đông. Ủ ám trong điều kiện kỵ khí ở 35 – 37oC / 20h ± 2h
Đếm và chọn khuẩn lạc
- Chọn tất cả các đĩa có ≤ 150 khuẩn lạc.
- Nếu hai đĩa của cùng một đậm độ có ít hơn hoặc bằng 150 khuẩn lạc điển hình, đếm tổng số khuẩn lạc trên cả hai đĩa và lấy giá trị trung bình.
- Nếu bốn đĩa của hai đậm độ liên tiếp có từ 15-150 khuẩn lạc điển hình, tính giá trị trung bình của hai đậm độ. Nếu tỷ số giữa giá trị trung bình cao hơn của hai đĩa cùng một đậm độ trên giá trị trung bình thấp hơn của đậm độ liền kề lớn hơn 2 thì lấy giá trị trung bình thấp hơn.
- Nếu đĩa cấy bị đen hoặc khơng thể đếm được các khuẩn lạc riêng rẽ thì đếm các đĩa của độ pha loãng cao hơn kế tiếp.
Đếm số khuẩn lạc điển hình trên mỗi đĩa và chọn ra 5 khuẩn lạc để thử khẳng định sinh hoá.
Thử khẳng định sinh hoá
a) Khả năng di động: trên môi trường nitrat di động, nuôi cấy trong điều kiện kỵ khí, 35-37oC/ 24h. Sau đó thử phản ứng chuyển nitrat thành nitrit:
- Nhỏ 0,2-0,5 ml thuốc thử phát hiện nitrit lên môi trường nitrat di động / 15 phút. Nếu sau 15 phút mà không thấy xuất hiện màu đỏ thì thêm một lượng nhỏ bụi kẽm và để yên 10 phút.Nếu vẫn khơng thấy xuất hiện màu thì kết luận phản ứng dương tính .
Lưu ý: phản ứng này phải làm trong hốt.
b) Khả năng lên men lactose và hoá lỏng gelatin: cấy vi sinh vật vào mơi trường lactose – gelatin. Ni cấy kỵ khí ở 35 – 37oC / 24h. Nếu môi trường chuyển sang màu vàng là vi khuẩn đã lên men đường lactose. Làm lạnh 1h các ống nuôi cấy ở 5oC và kiếm tra sơ bộ sự hố lỏng gelatin Nếu mơi trường vẫn ở dạng đặc thì để thêm 24 h nữa.
Tính kết quả:
- Nếu số khuẩn lạc thử khẳng định sinh hoá đúng lớn hơn hoặc bằng 80% tổng số khuẩn lạc đã đếm thì tồn bộ số khuẩn lạc này được coi là Cl. perfringens.
Mơn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 - Trong tất cả các trường hợp khác, số khuẩn lạc Cl. perfringens được
tính như sau:
- Ví dụ: Số khuẩn lạc trung bình trên hai đĩa là 75 Số khuẩn lạc chọn để thử khẳng định là 10 Số khuẩn lạc xác định đúng là 6 (60%)
Số khuẩn lạc Cl. perfringens = 75 x 0,60 = 45 - Chỉ để lại hai chữ số có nghĩa trong kết quả cuối cùng:
- Nếu số đó nhỏ hơn 100 thì làm trịn bằng bội số của 5 gần nhất. - Nếu số đó lớn hơn 100 và tận cùng bằng 5 thì làm trịn bằng bội số
của 20 gần nhất.
- Nếu số đó lớn hơn 100 nhưng khơng tận cùng bằng 5 thì làm trịn bằng bội số của 10 gần nhất.
- Để đánh giá những số thấp, lấy giá trị trung bình của phép đếm khuẩn lạc điển hình đã xác định và làm trịn tới số nguyên lớn nhất liền đó và đem nhân với giá trị nghịch đảo của độ pha loãng.
Báo cáo kết quả
- Nêu rõ phương pháp đã áp dụng, nhiệt độ nuôi cấy và kết quả ghi nhận được cũng như tất cả các chi tiết có thể có ảnh hưởng đến kết quả.
Mơn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4