- Trong số các loài Listeria, có một vài lồi có phản ứng CAMP dương
PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CAMPYLOBACTER Nguyên lý phương pháp
Nguyên lý phương pháp
• Phân lập và xác định Campylobacter ni cấy trên mơi trường chọn lọc trong khí trường vi hiếu khí ở 420C bằng các thử nghiệm sinh hố học đặc trưng.
Phạm vi áp dụng
• Thực phẩm và các sản phẩm thực phẩm.
Tài liệu viện dẫn
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 THIẾT BỊ-DỤNG CỤ - Máy đồng nhất mẫu, 10.000 – 20.000 vòng/phút - Tủ sấy 180 – 200oC - Nồi hấp áp lực - Tủ ấm 42 ±1oC
- Đĩa petri đường kính 90 – 100ml
- Bình ni cấy kị khí và túi tạo khí trường vi hiếu khí - Bình thuỷ tinh vơ trùng, dung tích 250 – 500ml
- Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm pH met hoặc giấy đo pH
- Túi đồng nhất mẫu có rãnh lọc
- Que cấy, đầu niken/crom hoặc platin. Que cấy thuỷ tinh
HĨA CHẤT-MƠI TRƯỜNG
- Canh thang Preston
- Thạch Charcoal cefoperazone desoxycholate - Thạch 5%máu thỏ (hoặc bò)
- Thành phần bổ sung vào môi trường cơ sở - Thạch dinh dưỡng
- Dung dịch Oxy già (H2O2 3%) - Dung dịch Natri hippurat 1% - Dung dịch Ninhydrin 3,5% - Dung dịch thử Oxydase - Bộ thuốc nhuộm Gram
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
* Tăng sinh trong canh thang Preston
• Cân 25 g thực phẩm, cắt nhỏ, xay nhuyễn hoặc dập bằng máy dập mẫu ở điều kiện vô trùng trong canh thang tăng sinh Preston cho tới khi đươc thể đồng nhất. Sau đó cho vào bình kỵ khí và tạo khí trường vi hiếu khí bằng túi tạo khí (chuẩn bị theo hướng dẫn trên túi tạo khí), đậy chặt nắp bình và ủ ấm ở 42oC từ 24 – 48
* Cấy chuyển lên môi trường thạch chọn lọc CCD
• Cấy lên hai đĩa thạch chọn lọc CCD, mỗi đĩa 1 ăng canh thang tăng sinh chọn lọc, ủ trong điều kiện vi hiếu khí như bước trên, ủ ấm 42oC từ 24 – 48 giờ để nhận dạng khuẩn lạc nghi ngờ.
Mơn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 • Khuẩn lạc nghi ngờ là Campylobacter dẹt, bóng, thường mọc lan, có
màu từ xám kem nhạt đến xám xanh. * Cấy chuyển lên môi trường thạch máu
• Từ khuẩn lạc nghi ngờ trên mơi trường thạch CCD, dùng que cấy ria sang môi trường thạch 5% máu bò hoặc thỏ. Ủ ấm trong điều kiện vi hiếu khí ở 42oC/24 giờ để thử khẳng định bằng các phản ứng sinh hoá.
* T hử khẳng định:
Bằng khuẩn lạc vi khuẩn nghi ngờ cấy trên môi trường thạch máu • Hình thể vi khuẩn
- Nhuộm Gram và soi trên kính hiển vi xác định hình thể vi khuẩn.
Campylobacter là vi khuẩn Gram âm (bắt màu đỏ), có hình lượn sóng
hoặc hình cánh chim. Trường hợp vi khuẩn ni cấy để q 48 h và có sự tiếp xúc với oxy khơng khí, Campylobacter chuyển sang dạng hình cầu. • Phản ứng Catalase
- Nhỏ một giọt H2O2 3% lên lam kính, dùng que cấy lấy một khuẩn lạc đặt vào giữa giọt H2O2. Nếu thấy sủi bọt là phản ứng dương tính.
• Phản ứng Oxydase (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Đặt một tờ giấy lọc nhỏ lên lam kính. Dùng que thuỷ tinh hoặc que gỗ vơ trùng lấy một ít khuẩn lạc phết lên tờ giấy lọc. Nhỏ vài giọt thuốc thử Oxydase lên, đọc kết quả trong 10 giây đầu.
- Phản ứng thuỷ phân Natri hippurat (phân biệt Campylobacter jejuni với các loài Campylobacter khác)
- Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc trên môi trường thạch máu cho vào ống nhựa 2 ml đã có sẵn dung dịch Natri hippurat 1% và nghiền đều cho đến khi dung dịch có màu sữa, đem ủ ấm ở 37oC/2 giờ. Sau đó lấy ra cho từ từ 200µl dung dịch Ninhydrin 3,5% bằng cách chạm nhẹ pipet vào thành ống để lớp dung dịch này nổi ở bên trên. Ủ ấm lần nữa ở 37oC trong 10 phút và lấy ra đọc kết quả.
- Phản ứng dương tính: xuất hiện màu tím sẫm hoặc xanh. - Phản ứng âm tính: khơng màu hoặc màu xám.
TIÊU CHUẨN XÁC ĐỊNH
• Gram âm, hình lượn sóng hoặc hình cánh chim • Catalase dương
Mơn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
BÁO CÁO KẾT QUẢ
• Nêu rõ phương pháp đã dùng và có hay khơng có Campylobacter trong 25 gam sản phẩm kiểm nghiệm, các thông tin về mẫu thử cũng như các điều kiện khác với tiêu chuẩn này.
Mơn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
TỔNG KẾT VI SINH THỰC PHẨM II
PHƯƠNG PHÁP NGUN LÝ TIẾN HÀNH
CÁC TÍNHCHẤT ĐIỂN HÌNH TRÊN ĐIỂN HÌNH TRÊN MTCL NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ TÍNH KẾT QỦA TỔNG SỐ VKHK -KT đổ đĩa -Ủ hiếu khí 37±10C - 48-72h Kết quả tính theo số KL Pha loãng bằng các dung dịch pha lỗng thơng thường 48 h đếm sơ bộ 72h đếm chính thức
Có hay khơng các đĩa thỏa mãn yêu cầu
Chọn đĩa 150 – 300 KL của hai đậm độ liên tiếp để tính KQ theo
công thức: N =
10g(10ml) + 90 ml dung dịch pha loãng Mỗi đậm độ cấy 2 đĩa Mỗi đĩa 1 ml
Tất cả các khuẩn lạc mọc hiếu khí(kể cả men, mốc)
Chọn đĩa 15 – 300 KL Giá trị cao/giá trị thấp >2 lấy
đậm độ thấp hơn để tính kết quả theo trung bình cộng
Ni cấy ít nhất 3 đậm độ Khơng có dạng khuẩn lạc điển hình nhất định Chọn hai đậm độ liên tiếp để tính kết quả Tổng KL ở đậm độ nguyên hoặc 10-1 <15: lấy KQ trung bình cộng các đĩa ở hai đậm độ được chọn Lật ngược đĩa Tất cả các đĩa khơng có KL mọc: < 1VSVHK/ml SP lỏng <1x1/d VSVHK/g SP dạng khác d xn n C ) 1 , 0 ( 1 +∑ 2
Mơn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH ĐIỂN HÌNH TRÊN CÁC TÍNHCHẤT MTCL MTCL NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ TÍNH KẾT QỦA TỔNG SỐ BT MEN MỐC -KT đổ đĩa -Ủ hiếu khí 28±10C 5 – 7 ngày Kết quả tính theo số khóm nấm
-Nấm men; pha lỗng bằng các dung dịch pha lỗng thơng thường -TSBT NM-NM hoặc tổng số nấm mốc: sử dụng nước pha lỗng có thạch
Phát triển hiếu khí 3 ngày đọc kết quả sơ bộ (72h)