- Có thể cư trú, tồn tại và nhân lên trong mơi trường; gắn và hình thành
màng sinh học
NGUỒN LÂY NHIỄM
• Mơi trường, dụng cụ, thiết bị, sản xuất, bao gói, thực hành vệ sinh người chế biến…
Mơn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
ĐƯỜNG LÂY TRUYỀN
• Qua đường tiêu hóa
• Nhiều động vật mang vi khuẩn nhưng khơng có triệu chứng
• Nguy cơ cao: các loại thực phẩm chưa chế biến như sữa tươi, thịt, cá và các loại đã chế biến như cá hun khói, phomat, xúc xích
PHÁT TRIỂN
• Có khả năng chịu đựng cao với tác động của nhiệt độ cao, lạnh, khô so với các vi sinh vật khơng sinh bào tử khác
• Phát triển được ở nhiệt độ bảo quản lạnh
• Có thể hình thành màng sinh học và tạo thành chỗ náu
NI CẤY• Hiếu khí • Hiếu khí • Nhiệt độ phát triển: -0.4 to 45°C • pH 4.39 – 9.4 • Nước hoạt tính ≥ 0.92 • Nồng độ muối ≤ 10%
PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN LISTERIA MONOCYTOGENESNguyên lý phương pháp Nguyên lý phương pháp
Phát hiện những vi sinh vật tạo thành những khuẩn lạc điển hình trên mơi trường thạch chọn lọc, có những đặc tính về hình thái, sinh lý, sinh hố đặc trưng phù hợp
Phạm vi áp dụng: Phát hiện Listeria monocytogenes trong thực phẩm và
thức ăn gia súc.
THIẾT BỊ - DỤNG CỤ
Sử dụng các thiết bị thơng thường của phịng thí nghiệm vi sinh, các thiết bị cần thiết để xử lý mẫu thử:
- Tủ sấy 180 – 200°C - Nồi hấp áp lực
Mơn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 - Tủ ấm 25 ±1°C, 30 ±1°C, 35 ±1°C hoặc 37 ±1°C
- Đĩa petri đường kính 90 – 100ml
- Pipet có vạch đã vơ trùng loại xả hết, dung tích 1,10 ml - Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 47 ± 2°C
- Que cấy platinum/iridum hoặc nikel/chromium, đường kính 3 mm. - Bình thuỷ tinh vơ trùng, dung tích 250 – 500ml
- Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm
- pH met, chính xác đến 0,01 đơn vị pH ở 25°C. - Xy lanh dung tích 50 ml tới 1000 ml
- Bình ni cấy kỵ khí.
- Túi tạo khí trường vi hiếu khí: 5% - 12% CO2 , 5 – 15% O2, 75 % N2
MƠI TRƯỜNG – THUỐC THỬ
• Mơi trường thạch Oxford • Mơi trường thạch Palcam • Canh thang Fraser
• Thạch Trypton soya yeast extract
• Canh thang Trypton soya yeast extract • Mơi trường thạch máu
• Thạch di động
• Canh thang Rhamnose và Xylose • Dung dịch hydrogen peroxit • Dung dịch đệm phosphat
CÁCH TIẾN HÀNH
Chuẩn bị mẫu thử và đậm độ pha loãng ban đầu:
- Thực phẩm lỏng: Hút 25 ml mẫu thử cho vào bình có sẵn 225 ml canh
thang Fraser (Đậm độ 10-1). Lắc đều.
- Thực phẩm dạng khác: Cân 25 g mẫu thử cho vào bình có sẵn 225 ml canh thang Fraser (Đậm độ 10-1). Lắc đều.
Nuôi cấy:
Tăng sinh lần 1: Ủ ấm dung dịch huyền phù ban đầu (Đậm độ 10-1) ở 30°C trong 24 h ± 2 h
Lưu ý : Dung dịch huyền phù có thể xuất hiện màu đen trong quá trình ủ ấm
Mơn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
Tăng sinh lần 2: Dùng pipet chuyển 0,1 ml dung dịch huyền phù ban đầu đã
ủ ấm ở 30°C trong 24h ± 2h vào ống nghiệm sẵn có 10 ml mơi trường tăng sinh Fraser, ủ ấm ở 35 - 37°C trong 48 h ± 2h
Nuôi cấy trên môi trường thạch chọn lọc
- Dùng que cấy lấy một ăng môi trường tăng sinh Fraser đã ủ ấm ở 35 - 37°C trong 48 h ± 2 h cấy lên hai đĩa thạch chọn lọc sao cho các khuẩn lạc mọc riêng rẽ và có thể dễ dàng quan sát hình thái:
- Thạch đĩa Oxford: ủ ấm ở 30°C, 35°C hoặc 37C từ 18 – 24h trong điều kiện hiếu khí.
- Thạch đĩa PALCAM: ủ ấm ở 30°C, 35°C hoặc 37°C từ 18 – 24h trong điều kiện vi hiếu khí.
- Lặp lại quá trình trên với hai đĩa thạch chọn lọc ( Oxford agar và PALCAM agar) bằng phương pháp cấy láng, sử dụng que cấy gạt.
Nhận định khuẩn lạc trên mơi trường chọn lọc:
• Trên thạch đĩa Oxford :
- Khuẩn lạc Listeria spp điển hình sau 24 h ni cấy thường nhỏ, đường kính khoảng 1 mm, màu xám có quầng đen bao quanh. Sau 48 h khuẩn lạc sẫm màu hơn, có thể hơi lục sáng, đường kính khoảng 2 mm, có quầng đen và lõm ở tâm.
• Trên thạch đĩa PALCAM:
- Những đĩa nuôi cấy trong điều kiện vi hiếu khí, sau thời gian ủ ấm bỏ ra ngồi 1 h để mơi trường trở lại màu hồng hoặc tím đỏ. Sau 24 h, khuẩn lạc
Listeria spp thường nhỏ hoặc rất nhỏ, màu hơi lục hoặc vàng lục, đường
kính khoảng 1,5 - 2 mm, có quầng đen bao quanh, đơi khi có tâm đen. Sau 48 h, khuẩn lạc Listeria spp có màu xanh lá cây, đường kính khoảng 1,5 – 2 mm, tâm lõm, có quầng đen bao quanh.
Thử khẳng định:
Chọn khuẩn lạc
• Trên mỗi đĩa thạch chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ để xác định Listeria
spp. Nếu trên một đĩa, số khuẩn lạc nghi ngờ ít hơn 5 thì chọn tất cả
Mơn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
Xác định trên mơi trường thạch Tryptone soya yeast extract
• Dùng que cấy cấy chuyển các khuẩn lạc nghi ngờ lên thạch đĩa
Tryptone soya yeast extract sao cho các khuẩn lạc có thể mọc riêng rẽ. Ủ ấm ở 300C, 350C hoặc 370C từ 18 – 24 h.
• Khuẩn lạc Listeria spp trên môi trường Tryptone soya yeast extract có đường kính từ 1 – 2 mm, lồi, màu nhạt, đục, bờ đều.
Thử tính chất SVHH:
- Catalase (+)
- Di động: hình ơ hướng lên trên ở 25°C/48h - Trực khuẩn Gr (+)
- Phân giải hồng cầu cừu dạng beta ở 35 – 37°C/ 24h - Lên men đường Rhamnose và Xylose
- CAMP test (+)
CAMP Test
- Là tên viết tắt của ba tác giả: Christie, Atkins, and Munch-Petersen)
phát hiện ra Streptococci nhóm B có một loại protein gọi là yếu tố CAMP hoặc “Protein B”, protein này có khả năng tương tác với beta – hemolysin được sinh ra bởi Staphylococcus aureus, kết quả là làm tăng kích thước vùng tan máu