SHIGELLOSIS
PHÁT HIỆN SHIGELLA SPP
* Nguyên lý phương pháp
- Phát hiện Shigella spp. trong mẫu thử bằng cách xác định khuẩn lạc điển hình trên mơi trường chọn lọc, có các phản ứng sinh hóa và huyết thanh đặc trưng trong phép thử khẳng định
* Phạm vi áp dụng
- Thực phẩm và thức ăn gia súc
* Thiết bị, dụng cụ
- Sử dụng các thiết bị thơng thường của phịng thí nghiệm vi sinh, các thiết bị cần thiết để xử lý mẫu thử :
Mơn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 - Tủ sấy 180 – 2000C
- Nồi hấp áp lực - Tủ ấm 25 – 30 ±1oC
- Đĩa petri đường kính 90 – 100ml
- Pipet có vạch đã vơ trùng loại xả hết 1,5,10 ml - Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 42 70 ±1oC
- Bình thuỷ tinh vơ trùng, dung tích 250 – 500ml - Ống nghiệm vơ trùng 16 – 18 mm
- pH met, chính xác đến 0,1 đơn vị pH ở 25oC
* Môi trường, thuốc thử
- Canh thang Shigella - Thạch Macconkey
- Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) - Thạch Hektoen Enteric
- Thạch dinh dưỡng
- Thạch Triple Ion Sugar (TSI) - Môi trường LDC, ODC
- Mơi trường Bromocresol tía
- Thuốc thử Kovacs, β-galactosidase, ONPG - Kháng huyết thanh Shigella
* CÁCH TIẾN HÀNH
1. Chuẩn bị mẫu thử và dung dịch huyền phù ban đầu:
- 25g mu thử đã đồng nhất trong 225 ml canh thang Shigella hoặc trypton soya có bổ sung 0,5 μg/ml novobiocin để được dung dịch huyền phù ban đầu
- Lưu ý: mẫu thử cần được phân tích ngay vì Shigella spp. dễ chết trong điều kiện không thuận lợi
2. Tăng sinh
- Ủ canh thang Shigella ở 41,5 ± 1oC từ 16 – 24 giờ
3. Cấy chuyển lên môi trường chọn lọc
- Macconkey - XLD
- Hektoen Enteric
Mơn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 4. Nhận dạng khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc
- Trên Macconkey: KL nâu đỏ, trong mờ, không lên men đường lactose. Riêng Shigella sonnei có thể có màu hồng nhạt
- Trên XLD: trong mờ, tâm màu đỏ, không lên men đường lactose - Trên HE: khuẩn lạc ướt, màu xanh lá cây. Riêng Shigella sonnei có
khuẩn lạc lồi.
- Trên môi trường Deoxycholate Citrate Agar, khuẩn lạc Shigella có màu đỏ nhạt (mơi trường có màu đỏ cam, hơi đục).
5. Phép thử khẳng định
- Mỗi đĩa chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ
- Cấy các khuẩn lạc riêng rẽ lên thạch dinh dưỡng, ủ ở 37 ± 1oC từ 18 – 24 giờ để thử khẳng định sinh hóa và huyết thanh
* Thử khẳng định sinh hóa:
- Lên men đường và sinh H2S: cấy vào thạch ống TSI, ủ ở 37 ± 1oC/24 ± 3 giờ
- Di động: cấy vào ống thạch mềm, ủ ở 37 ± 1oC/ 18 - 24 giờ
- Phân giải Ure: cấy vào thạch ống hoặc canh thang Ure, ủ ở 37 ± 1oC/24 ± 3 giờ
- Phát hiện Lysinedecarboxylase: cấy vào MT LDC, ủ ở 37 ± 1oC/24 ± 3 giờ
- Phát hiện Ornithinedecarboxylase: cấy vào MT ODC, ủ ở 37 ± 1oC/24 ± 3 giờ
- Sinh Indol: Cấy khuẩn lạc cần xác định vào MT trypton/tryptophan, ủ ở 37 ± 1oC/24 ± 3 giờ, sau đó cho thêm 1 ml thuốc thử Kovacs
- Phát hiện β- galactosidase: cấy một ăng khuẩn lạc vào 0,25 ml NaCl 0,85%. Nhỏ 1 giọt Toluen và lắc đều, để ở 37oC/vài phút. Sau đó thêm 0,25 ml thuốc thử ONPG và lắc đều, để ở 37 ± 10C/24 ± 3 giờ
- Sử dụng Carbonhydrate: cấy vào canh thang Carbonhydrate, ở 37 ± 1oC/24 ± 3 giờ
* Thử khẳng định với kháng huyết thanh đặc hiệu:KN O(A,B,C,D)
- Shigella spp. Khơng di động, khơng có kháng ngun lơng. Việc phân biệt các chủng dựa trên phản ứng ngưng kết với kháng nguyên O đa giá và đơn giá đặc hiệu
- Cấy chuyển khuẩn lạc cần xác định lên thạch dinh dưỡng, ủ ở 37 ± 1oC/24 giờ
Mơn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 * Loại trừ các chủng tự ngưng kết:
- Nhỏ 1 giọt NaCl 0,85% lên lam kính - Dùng que cấy lấy một ít KL, nghiền đều - Lắc nhẹ trong 30 – 60 giây
- Nếu thấy có hạt ngưng kết thì bỏ đi khơng thử tiếp * Ngưng kết với kháng nguyên O
- Làm tương tự, thay NaCl 0,85% bằng kháng nguyên O đa giá
- Nếu ngưng kết với kháng nguyên O đa giá thì thử tiếp với các loại kháng nguyên đơn giá để định typ nếu có điều kiện (A,B,C,D)
- Nếu có kháng ngun bề mặt K: đun sơi dịch vi khuẩn 30 phút, sau đó thử lại với KN O đa giá và đơn giá
- Báo cáo kết quả
- Nêu rõ phương pháp sử dụng và kết quả thu được, kể cả những thông tin chi tiết về phép thử
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4