CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4 Xác định tác nhân gây bệnh vàng lá thối rễ trên cây cam Sành trong
điều kiện nhà lưới
3.4.1 Phân lập nấm Fusarium solani gây bệnh vàng lá thối rễ trên cây cam
Sành
a) Phương tiện nghiên cứu
+ Chọn cây cam Sành tại các vườn trồng cam ở huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long có triệu chứng điển hình trên lá và rễ được ghi nhận thông tin và thu thập các mẫu rễ.
+ Môi trường WA 2% (Water Agar) cho phân lập nấm Fusarium solani
(Burgess et al., 2008). Môi trường WA 2% được điều chỉnh pH đến 5,5.
+ Môi trường PDA thực hiện tách ròng và lưu trữ nấm Fusarium solani.
+ Chất kháng khuẩn Streptomycin 0,5% bổ sung vào môi trường cho phân lập nấm.
+ Thực hiện tại Khu thực nghiệm, Phịng thí nghiệm Vi sinh vật đất - Bộ môn Khoa họcđất, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ
b) Phương pháp nghiên cứu
- Mẫu rễ sau khi thu được thực hiện tại Phịng thí nghiệm Vi sinh-Bộ môn Khoa học đất gồm các bước sau:
+ Rửa mẫu rễ cam Sành đã chọn dưới vòi nước máy để loại bỏ bụi bẩn + Chọn mẫu rễ có phần ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe
+ Khử trùng bề mặt mẫu rễ cam bằng cồn ethyl 70% trong thời gian 1 phút
+ Làm khô bề mặt mẫu rễ cam bằng giấy vô trùng
+ Dùng kéo tiệt trùng cắt mẫu rễ thành những mảnh nhỏ ở vị trí ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe
+ Dùng kẹp tiệt trùng chuyển những mẫu rễ vừa cắt đặt lên môi trường WA 2% có bổ sung kháng khuẩn (streptomycin 0,5%), mỗi mẫu thực hiện 3 lần lặp lại trên đĩa petri với 8 mẫu rễ/đĩa. Sau đó, đặt các mẫu đã cấy vào tủ ủ và ủ ở nhiệt độ 300C cho nuôi cấy.
+ Sau 24 giờ nuôi cấy, khi sợi nấm đã phát triển trên môi trường WA 2%, tiến hành đục khuẩn ty nấm thành từng khoanh trịn (d= 5 mm) ở gần rìa của tản nấm và cấy vào đĩa petri có chứa mơi trường PDA đã bổ sung kháng
khuẩn streptomycin 0,5% thực hiện tiến hành tách ròng cho đến khi được dòng thuần.
- Khảo sát đặc điểm hình thái, màu sắc nấm và kích thước bào tử xác định nấm Fusarium solani: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức tương ứng với 1 chủng nấm Fusarium solani được phân lập từ 1 mẫu rễ và thực hiện 2 lần lặp lại trong điều kiện
phịng thí nghiệm. Các chủng nấm được ni cấy trên môi trường PDA ở điều kiện nhiệt độ phịng thí nghiệm (28-30oC) trong 48 giờ cho sợi nấm phát triển
sau đó tiến hành quan sát và mơ tả hình thái, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc nấm. Thí nghiệm khảo sát hình thái, đặc điểm bào tử được thực hiện theo
phương pháp slide culture để xác định nấm Fusarium solani (Liyanapathirana and Wijiedasa, 2012)
c) Các chỉ tiêu ghi nhận
- Sự thay đổi về màu sắc, hình dạng của tản nấm trên mơi trường PDA - Đường kính tản nấm ở các thời điểm 2 và 5 ngày sau khi cấy.
- Hình dạng, màu sắc, kích thước bào tử ở thời điểm 2 ngày sau khi cấy bằng phương pháp slide culture.
- Thời gian hình thành bào tử trên mơi trường ni cấy
3.4.2 Khảo sát khả năng gây bệnh của nấm Fusarium solani trong điều kiện nhà lưới kiện nhà lưới
Thí nghiệm được thực hiện trong nhà lưới và phịng thí nghiệm Vi sinh của Bộ môn Khoa học Đất, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ, trong thời gian từ tháng 11/2015 đến tháng 5/2016.
a) Phương tiện nghiên cứu
- Cây cam giống: được mua từ trại giống tại huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh
Long. Cây giống được chọn sinh trưởng khỏe mạnh, khơng có triệu chứng bệnh, đồng nhất về độ tuổi, chiều cao và số lá (chiều cao 30 cm, mọc từ 10 lá thật trở lên).
- Giá thể trồng cam: được phối trộn từ đất thịt pha cát, phân hữu cơ và mụn dừa với tỷ lệ 3 đất : 1 phân hữu cơ : 1 mụn dừa, tỷ lệ được xác định theo thành phần khối lượng. Thực hiện vô trùng giá thể ở nhiệt độ 121oC trong 30 phút với 2 lần cách nhau 7 ngày.
- Nguồn nấm: Mười ba dòng nấm Fusarium solani được phân lập trên
môi trường WA 2% ở trên và được nuôi cấy trên môi trường PDA ở nhiệt độ
phòng cho đến khi tạo bào tử. Thực hiện pha huyền phù bào tử bằng cách cho 20 mL nước cất thanh trùng vào các đĩa petri chứa nấm, dùng một miếng lame sạch cạo nhẹ trên bề mặt mơi trường, sau đó huyền phù được lọc lại bằng 3 lớp vải mỏng vô trùng để loại bỏ sợi nấm. Rút 200 µL huyền phù bào tử, đếm mật
số dưới kính hiển vi bằng lam đếm hồng cầu. Từ đó xác định lượng nước cần
pha lỗng để có huyền phù bào tử với mật số cần sử dụng (5 x 106 bào tử/mL)
(Dương Minh và ctv., 2010).
b) Phương pháp nghiên cứu
- Thực hiện chủng nấm gây bệnh:
+ Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, 5 lần
lặp lại, 13 nghiệm thức bao gồm 12 chủng nấm đã phân lập và một nghiệm thức đối chứng không chủng nấm, chỉ xử lý bằng nước cất vô trùng, mỗi lặp lại là 1 cây cam trồng trong một chậu giá thểcó đường kính đáy l2 cm.
+ Thực hiện chủng nấm gây bệnh: Sau khi cây đã phát triển khỏe
mạnh trong bầu giá thể, tiến hành tưới vào gốc cam huyền phù nấm chứa 5 x 106 bào tử/mL. Sau 30 ngày chủng bệnh, tiến hành đánh giá chỉ số bệnh, tỷ lệ cây chết do bệnh và cấp bệnh (Dương Minh, 2010).
- Thu thập và phân lậplại nấm Fusarium sp. Thu thập và phân lập lại
sự hiện diện của nấm Fusarium sp. ở 13 nghiệm thức đã bố trí thí nghiệm ở giai đoạn 60 ngày sau khi chủng (NSKC).
+ Khảo sát mật số nấm Fusarium sp. sau khi bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm đánh giá mật số nấm Fusarium sp. được thực hiện tại phịng
thí nghiệm Vi sinh Bộ mơn Khoa học đất. Sau khi hồn thành thí nghiệm đánh giá tỷ lệ bệnh trên cây cam của mỗi nghiệm thức ở giai đoạn 60 ngày NSKC, tiến hành xác định lại mật số nấm Fusarium sp. trong giá thể trên mỗi nghiệm thức. Các mẫu giá thể được xác định ẩm độ trước khi phân tích, từ đó làm cơ sở để xác định mật số nấm Fusarium sp. trên 1 gram giá thể khơ. Quy trình được thực hiện như sau: Cân 1 gram giá thể tươi có ẩm độ xác định cho vào
ống falcon 50 mL, sau đó thêm vào 20 mL dung dịch phosphate buffer gồm
31,5 gram NaHPO4.2H2O và 27,3 gram Na2PO4.12 H2O pha trong 1000 mL
nước cất. Mỗi mẫu đất được thực hiện với 2 lần lặp lại. Mẫu được lắc trên máy lắc ngang với tốc độ 130 vòng/phút trong 1 giờ. Hút 1 mL dung dịch cho vào ống nghiệm chứa sẵn 9 mL nước cất vơ trùng, pha lỗng dãy dung dịch với hệ số hịa lỗng 10. Hút 50 µL dung dịch huyền phù vi sinh vật trong dãy nồng độ pha loãng và được trải đều trên bề mặt môi trường PDA (đã bổ sung kháng khuẩn Streptomycin 0,5%) bằng que chà thủy tinh. Sau đó mẫu được đặt trong tủ ủ ở nhiệt độ 30oC trong 2 ngày. Tiến hành đếm số khuẩn lạc sống của nấm hiện diện trên đĩa petri và tính tốn kết quả số liệu.
c) Các chỉ tiêu nghiên cứu
- Tính chỉ số bệnh và tỷ lệ cây chết do bệnh và cấp bệnh theo công thức:
Trong đó: n1, n2, n3, n4, n5 lần lượt là số lá bị bệnh cấp 1,2,3,4,5 N: tổng số lá có cấp bệnh
C: cấp bệnh quy ước cao nhất
Cấp bệnh theo thang Carling et al. (1999) gồm có 5 cấp bệnh Cấp 0: khơng có lá bệnh Cấp 1: 1 đến 10% lá bệnh Cấp 2: Trên 10% đến 20% lá bị bệnh Cấp 3: Trên 20% đến 60% lá bị bệnh Cấp 4: Trên 60% đến 80% lá bị bệnh Cấp 5: Trên 80% lá bị bệnh
- Mật số khuẩn lạc của nấm Fusarium sp. gây bệnh trong giá thể trồng
cam.