CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.6 Sản xuất phân hữu cơ vi sinh
- Địa điểm: Tại trại thực nghiệm và Phịng thí nghiệm Vi sinh vật đất,
Bộ môn Khoa học đất, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ
- Thời gian: Từ tháng 11/2015 đến tháng 05/2016 3.6.1 Phương tiện nghiên cứu
- Nguồn chất hữu cơ: Sử dụng 1,2 tấn rơm lúa được thu tại các cánh đồng lúa vụ Đơng Xn ở huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long sử dụng cho ủ phân hữu cơ theo phương pháp chỉ sử dụng rơm từ lúa làm nguyên liệu ủ
(Goyal and Sindhu, 2011).
- Các dịng nấm có ích được chủng vào phân hữu cơ cho sản xuất 4 loại phân hữu cơ vi sinh (HCVS) như được trình bày ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2: Vai trò của các dòng nấm trong phân HCVS
Tên dòng nấm Loại phân HCVS
Nguồn nấm được phân lập
Trichoderma sp. Phân HCVS 1 Đất vùng rễ trồng cam
Gongronella butleri Phân HCVS 2 Đất trồng lúa
Trichoderma sp. +
Gongronella butleri Phân HCVS 3
Đất vùng rễ trồng cam và đất
trồng lúa
Trichoderma sp. Phân HCVS 4 Sản phẩm thương mại
- Môi trường Trichoderma Minimal Medium (TMM) bổ sung vào bột gạo nấu chín để nhân mật số gồm: 10% bột gạo, 15 g/L KH2PO4, 5 g/L (NH4)2SO4, 0.005 g/L FeSO4 * 7H2O, 0.0016 g/L MnSO4 * H2O, 0.0014 g/L ZnSO4 * H2O, 0.0037 g/L CoCl12 * 6H2O, 0.6 g/L MgSO4, 0.6 g/L CaCl2 (Ries
et al., 2013).
- Môi trường Trichoderma-selective medium (TSM) cho phân tích mật
số nấm Trichoderma sp. (Elad et al., 1981).
- Chất kháng khuẩn streptomycin 0,04% và cloramphenicol 0,025% (El- Mohamedy et al., 2012) được bổ sung vào mơi trường bột gạo nấu chín và mơi trường TSM (Ries et al., 2013).
3.6.2 Phương pháp nghiên cứu
a) Ủ phân hữu cơ
Rơm trước khi ủ được ngâm nước để điều chỉnh ẩm độ lên 70%, đảm bảo sự phát triển của vi sinh vật được chủng vào khối ủ. Sau khi ủ, mỗi 15, 30, 45 và 60 ngày ủ tiến hành kiểm tra ẩm độ để bổ sung nước và thực hiện đảo trộn và ủ đến 75 ngày tiến hành mở đống ủ để bốc thoát hơi nước tự nhiên.
Phân hữu cơ được trộn đều, lấy mẫu và xác định thành phần dinh dưỡng (carbon hữu cơ, Nts, P2O5, K2O tổng số) và ẩm độ sau khi ủ. Hàm lượng dinh dưỡng trong phân HCVS được trình bày ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3 Thành phần dinh dưỡng của phân hữu cơ từ rơm rạ
STT Chi tiêu phân tích Kết quả (%)
1 Carbon hữu cơ 46,67
2 N tổng số 1,74
3 P2O5 tổng số 0,22
4 K2O tổng số 2,16
b) Chủng vi sinh vật có ích vào phân hữu cơ
- Các chủng nấm được nhân sinh khối trong túi lên men: Bột gạo 10% được nấu trong mơi trường khống TMM đến khi bột nở hoàn toàn. Chuyển lượng bột gạo trên vào túi polypropylene (Hình 3.3), sau đó cho tiến hành vơ trùng hỗn hợp trên ở 121oC trong 30 phút. Các dịng nấm có ích được ni cấy
trên mơi trường PDA trước đó, đảm bảo sợi nấm phát triển tốt. Thực hiện
chuyển đĩa agar chứa nấm có ích vào trong túi bột gạo nấu chín (các bước thực hiện trong điều kiện vô trùng). Sau 2 tuần nuôi cấy khi sợi nấm đã phát triển đầy đủ trong túi bột gạo nấu chín tiến hành khảo sát mật độ nấm.
Hình 3.3: Túi lên men để nhân mật số nấm bổ sung vào nguyên liệu hữu cơ
- Thực hiện cân 1 gram mẫu bột gạo chứa nấm cho vào ống falcon 50
lần lặp lại. Mẫu được lắc trên máy lắc ngang với tốc độ 130 vòng/phút trong 1 giờ. Hút 1 mL dung dịch cho vào ống nghiệm chứa sẵn 9 mL nước cất vô
trùng, pha loãng dãy dung dịch với hệ số hịa lỗng 10 lần. Hút 50 µL dung dịch huyền phù vi sinh vật trong dãy nồng độ pha lỗng và được trải đều trên bề mặt mơi trường TSM bằng que chà thủy tinh. Sau đó mẫu ni cấy trong
điều kiện nhiệt độ phòng. Tiến hành đếm số khuẩn lạc của nấm hiện diện trên đĩa petri ở giai đoạn mỗi 2 ngày sau khi ni cấy và tính tốn kết quả số liệu.
- Mật số nấm có ích được chủng vào chất hữu cơ nền tương ứng với 4 công thức phân hữu cơ vi sinh với mật số chủng vào là 2,0x106 cfu/g chất hữu cơ nền. Sự lưu tồn của mật số vi sinh vật có ích được đánh giá sau 15 ngày chủng vào chất hữu cơ nền đảm bảo mật số vi sinh vật có ích trong phân hữu cơ vi sinh đạt từ 106cfu/g trở lên (Bảng 3.4), đảm bảo theo tiêu chuẩn ngành
TCVN 7185-2002 và Thông tư số 41/2014/TT-BNNPTNT ngày 13/11/2014.
Bảng 3.4 Mật số nấm có ích của bốn loại phân HCVS
TT Loại phân
HCVS
Nấm có ích trong phân HCVS sau khi
chủng Mật số bào tử
(cfu/g)
1 Phân HCVS 1 Trichoderma sp. 3,55 x 107 2 Phân HCVS 2 Gongronella butleri 2,03 x 108
3 Phân HCVS 3 Trichoderma sp. 4,50 x 10
6
Gongronella butleri 3,50 x 107
4 Phân HCVS 4 Trichoderma sp. 3,62 x 107
3.7 Đánh giá hiệu quả của phân HCVS đến cải thiện độ phì nhiêu đất, giảm bệnh vàng lá thối rễ
- Địa điểm: Tại trại thực nghiệm và phòng Vi sinh, Bộ môn Khoa học
đất, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ
- Thời gian: Từ tháng 05/2016 đến tháng 10/2017 3.7.1 Bố trí thí nghiệm
- Vườn cam Sành được chọn thực hiện bố trí thí nghiệm thuộc ấp Tường
Nhơn, xã Tường Lộc, huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long. Vườn được chọn thí nghiệm phù hợp với mục tiêu nghiên cứu của luận án và thuận tiện cơng tác bố trí thí nghiệm, cơng tác theo dõi, chăm sóc, bố trí thu thập các chỉ tiêu theo dõi và tính hợp tác cao của hộ nơng dân. Vườn thí nghiệm có đất canh tác thuộc nhóm tuổi líp và tuổi cây phổ biến của vùng trồng cam Sành, thuộc nhóm vườn thể hiện bạc màu đất, biểu hiện bệnh VLTR và đang gặp khó khăn về
năng suất trái. Vườn thí nghiệm ngồi thực địa có đặc điểm sau:
+ Vườn cam Sành có tuổi liếp 22 năm trồng trên liếp. Đất tại vườn cam
Phẫu diện đất được chia thành bốn tầng đất chính ở độ sâu từ 0-200 cm (Ap,
Bg1, Bg2 và Cr). Đất có tầng sinh phèn xuất hiện ở độ sâu trên 90cm. Tầng
đất ở độ sâu từ 0-90 cm thuộc nhóm đất đang phát triển bán thuần thục.
+ Diện tích vườn 6.000 m2
+ Vườn cam khơng được bón phân hữu cơ
+ Cây cam đang giai đoạn cho trái, đã trồng được 6 năm, mật độ 250
cây/1.000m2. Cây cam Sành được chọn thí nghiệm tương đối đồng đều về tuổi, chiều cao, tán cây và cây đang trong thời kỳ cho trái. Cây cam Sành được chọn đang biểu hiện bệnh VLTR. Dấu hiệu bệnh được nhận diện dựa trên đặc
điểm biểu hiện vàng lá giống như khi thực hiện thí nghiệm xác định tác nhân
gây bệnh VLTR trên vườn cam Sành. Các cây cam được chọn có tỷ lệ bệnh
VLTR tương đối đồng đều nhau và kết quả phân tích thống kê cho thấy tỷ lệ
bệnh giữa các nghiệm thức không khác biệt có ý nghĩa thống kê, giao động từ 24 – 35% (Hình 3.4). Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên một nhân tố, 4 lần lặp lại trên mỗi nghiệm thức, 2 cây cho mỗi lần lặp lại. Các nghiệm thức được bố trí:
NT1: Bón phân NPK theo nơng dân 360 g N - 195 g P2O5 - 55 g K2O/cây
(đối chứng).
NT2: Bón phân NPK theo khuyến cáo (NPK-KC) 250 g N - 50 g P2O5 - 250 g K2O/cây (Võ Thị Gương và ctv., 2016).
NT3: Bón phân NPK-KC + 8 kg phân HCVS có chủng nấm
Trichoderma asperellum/cây.
NT4: Bón phân NPK-KC + 8 kg phân HCVS có chủng nấm Gongronella
butleri/cây.
NT5: Bón phân NPK-KC + 8 kg phân HCVS có chủng nấm Trichoderma asperellum và Gongronella butleri/cây.
NT6: Bón phân NPK-KC + 8 kg phân HCVS có chủng nấm
Hình 3.4: Tỷ lệ bệnh VLTR trên các cây cam Sành theo nghiệm thức được chọn bố trí thí nghiệm
+ Mẫu đất được thu thập để đánh giá các đặc tính vật lý, hóa học đất của vườn cam Sành trước khi bố trí thí nghiệm (Bảng 3.4)
Bảng 3.4: Đặc tính vật lý và hóa học đất vườn cam Sành khi bố trí thí nghiệm
Chỉ tiêu Giá trị Đặc tính vật lý đất Sa cấu Thịt pha sét Dung trọng 1,25 Đặc tính hóa học đất pH (tỉ lệ 1:2,5) 5,43 Đạm tổng số (%N) 0,086 Đạm hữu dụng (mg/kg) 38,7 Lân hữu dụng (mg/kg) 9,45
Kali trao đổi (cmol/kg) 0,05
Chất hữu cơ (%C) 1,78
CEC (cmol/kg) 15,81
- Phân hữu cơ vi sinh được sử dụng cho thí nghiệm có thành phần dinh
dưỡng được trình bày ở Bảng 3.5:
Bảng 3.5 Thành phần dinh dưỡng của phân hữu cơ vi sinh từ rơm rạ
STT Chi tiêu phân tích Kết quả (%)
1 Carbon hữu cơ 46,67
2 N tổng số 1,74
3 P2O5 tổng số 0,22
4 K2O tổngsố 2,16
5 Ẩm độ 22,3
6 Mật số nấm có ích (cfu/g) > 106(Bảng 3.4)
- Phân bón NPK được sử dụng trên vườn cam bố trí thí nghiệm gồm: + Phân Yara Mila Complex NPK: 12-11-18
+ Phân Ure, DAP, Kali - Vôi CaCO3
3.7.2 Phương pháp bón phân
- Tất cả các nghiệm thức được bón vơi CaCO3 (2 tấn/ha) ở thời điểm sau
khi thu hoạch, vơi được bón trước 15 ngày khi bón phân vơ cơ và hữu cơ vi sinh. Phân hữu cơ vi sinh sau khi ủ được bón vào gốc cam Sành với liều lượng
20 tấn/ha (tương đương 8 kg/gốc). Tầng đất mặt hình vành khăn được xới nhẹ để vùi phân hữu cơ vi sinh vào trong đất.
- Phân vô cơ được chia thành 4 lần/mỗi vụ thu hoạch trái: Lần 1 (1/4 N - 1/2 K2O - tồn bộ lân, Lần 2 và 3 (Bón 1/4 N), Lần 4 (1/4 N -1/2 K2O ) (Bảng 3.6). Phân hữu cơ vi sinh và phân vô cơ được bón cách gốc 50 cm theo hình chiếu bên trong tán cây.
Bảng 3.6 Lịch bón phân và thu mẫu đất trên vườn cam bố trí thí nghiệm
3.7.3 Phương pháp thu mẫu đất và các chỉ tiêu phân tích
a) Thu mẫu đất trước khi bố trí thí nghiệm
Vị trí lấy mẫu đất theo 4 điểm đường chéo được thực hiện tại mỗi cây, mẫu đất được thu ở độ sâu 0 - 20 cm, cách gốc 50 cm để trộn thành một mẫu. Thực hiện thu 9 mẫu đất ngẫu nhiên trên diện tích 6.000 m2 theo quy tắc
đường chéo của vườn, để đánh giá các đặc tính lý, hóa và sinh học đất vườn
bố trí thí nghiệm. Mẫu đất được lấy ở tầng đất 0-20 cm, thu tại vị trí cách gốc 50 cm, lấy 4 điểm theo hình chéo hình vng tại mỗi cây và trộn các mẫu đất tất cả các cây thành 1 mẫu. Mẫu đất thu thập được trữ trong phịng thí nghiệm
ở nhiệt độ phịng cho phân tích các chỉ tiêu:
+ Thành phần cơ giới đất
+ pH đất, CHC, Nhd , Phd, K+, Ca2+, K+, Mg2+, Na+ trao đổi và CEC đất. + Tổng mật số vi sinh vật đất, mật số nấm Trichoderma sp. và mật số nấm Fusarium sp. trong đất.
Công việc thực hiện Thời gian Ghi chú
Lịch bón phân cho thu hoạch trái vụ 1
Bón phân lần 1 Sau thu hoạch Bón 1/4N - 1/2 K2O - toàn bộ lân và phân hữu cơ vi sinh
Bón phân lần 2 Khi cây ra hoa Bón 1/4N
Thu mẫu đất 3 tháng sau khi bón phân
Bón phân lần 3 Sau khi đậu trái 1 tháng Bón 1/4N
Bón phân lần 4 Giai đoạn phát triển trái (trước thu hoạch 2 tháng) Bón 1/4N - 1/2 K2O Thu hoạch trái 8-10 tháng sau khi bón phân đợt 1
Lịch bón phân cho thu hoạch trái vụ 2
Bón phân lần 1 Sau thu hoạch Bón 1/4N - 1/2 K2O - tồn bộ lân
Bón phân lần 2 Khi cây ra hoa Bón 1/4N
Bón phân lần 3 Sau khi đậu trái 1 tháng Bón 1/4N
Bón phân lần 4 Giai đoạn phát triển trái
(trước thu hoạch 2 tháng) Bón 1/4N - 1/2 K2O
Thu mẫu đất 15 tháng sau khi bón phân đợt 1
b) Thu mẫu sau ba tháng bón phân hữu cơ vi sinh
- Mẫu đất được thu ở thời điểm ba tháng sau khi bón phân HCVS. Đối với chỉ tiêu phân tích đặc tính dinh dưỡng đất: mẫu đất được thu ở độ sâu 0 - 20 cm, cách gốc 50 cm ở vị trí đã bón phân HCVS theo hình vành khăn. Ở
mỗi cây, đất được thu tại 4 điểm theo hình chéo gốc, được trộn thành 1 mẫu. Mẫu đất sau khi thu được cho vào túi nhựa, ghi nhãn và mang về phịng phân tích phơi khơ trong điều kiện phịng thí nghiệm. Mẫu đất sau khi khô được
nghiền qua rây 2 mm và 0,5 m cho phân tích các chỉ tiêu:
+ Đối với chỉ tiêu hóa học đất: pH đất, hàm lượng CHC, Nhd, Phd, K+, Ca2+, K+, Mg2+, Na+ trao đổi và CEC đất.
+ Đối với chỉ tiêu vật lý đất: Mẫu đất được thu ở tầng 0 - 20 cm, thu theo rìa tán cây cách gốc 50 cm, mẫu đất được thu bằng ring theo phương pháp vng góc với bề mặt phẫu diện bằng dụng cụ khoan. Mẫu đất thu thập mang về phịng phân tích bộ mơn Khoa học Đất để phân tích, ghi nhận các chỉ tiêu về đặc tính vật lý đất. Các chỉ tiêu phân tích: dung trọng và tỷ trọng, độ xốp đất được tính dựa trên kết quả dung trọng và tỷ trọng.
+ Đối với đặc tính sinh học đất: Mẫu đất được thu tại vùng rễ của cây
cam. Ở mỗi cây, đất được thu tại 4 vị trí chéo gốc theo hình vành khăn đã bón phân HCVS. Mẫu đất sau khi được thu thập được đựng trong túi giấy đã được
vô trùng trước và trữở nhiệt độ 4oC cho phân tích chỉ tiêu: tổng mật số vi sinh vật đất, mật số nấm Trichoderma sp. và mật số nấm Fusarium sp.
3.7.4 Thu mẫu đất qua hai vụ thu hoạch trái
Mẫu đất cuối vụ được thu tại thời điểm sau thu hoạch trái vụ hai (15
tháng sau khi bón HCVS). Thực hiện thu mẫu đất như phương pháp thu mẫu
đất giữa vụ. Mẫu đất thu thập được trữ trong phịng thí nghiệm ở nhiệt độ
phịng cho phân tích các chỉ tiêu.
+ Vật lý đất: phân tích độ bền cấu trúc đất và độ xốp đất.
+ Hóa đất: pH đất, CHC, hàm lượng carbon hữu cơ và đạm hữu cơ dễ
phân hủy, Nhd, Phd, K+, Ca2+, K+, Mg2+, Na+trao đổi và CEC đất.
+ Sinh học đất: Mẫu đất được thu thập trên từng nghiệm thức ở vị trí cách gốc 50 cm, ở độ sâu tầng đất 0-20 cm. Mẫu đất thu thập được trữ lạnh ở
4-5oC cho đến khi phân tích. Đếm tổng mật số vi sinh vật trong đất và mật số
nấm Trichoderma sp., Fusarium sp. ở từng nghiệm thức.
3.7.5 Các chỉ tiêu ghi nhận
- Năng suất trái thu hoạch ở vụ 1 và vụ 2
- Ghi nhận và đánh giá cấp độ bệnh vàng lá thối rễ trên cây theo từng nghiệm thức theo phương pháp phân loại cấp độ bệnh của Jones (1998).
3.7.6 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu
a) Phương pháp phân tích một số chỉ tiêu hóa học đất
- Giá trị pH đất được đo bằng pH kế với tỷ lệ đất: nước là (1 : 2,5).
- Chất hữu cơ được xác định theo phương pháp Walkley - Black (Nelson and Sommers, 1982).
- C hữu cơ dễ phân hủy: Được xác định bằng cách cho đất tác dụng với
HCl 6N với tỉ lệ 1/10 đun nóng ở 1000C. Sau đó dùng phương pháp Walkley
Black, chuẩn độ bằng FeSO4 0,5N đểxác định lượng chất hữu cơ còn lại. Chất hữu cơ dễ phân hủy được xác định bằng % chất hữu cơ ở nhiệt độ thường trừ đi % chất hữu cơ đun nóng.
- Lân hữu dụng trong đất (% P) được xác định theo phương pháp Bray 2. Dung dịch sau khi ly trích được đem so màu trên máy quang phổ ở bước sóng
880 nm (Bray and Kurtz, 1945).
- Đạm tổng số được xác định bằng phương pháp Kjeldahl.
- Đạm hữu dụng trong đất: NH4+ và NO3- trong mẫu đất được ly trích