CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5 Phân lập và tuyển chọn các dòng nấm có khả năng phân hủy chất hữu
cơ và đối kháng nấm gây bệnh Fusarium solani
3.5.1 Phân lập và tuyển chọn các dòng nấm từ vùng đất trồng lúa đến
tăng nhanh khảnăng phân hủy chất hữu cơ
- Địa điểm: Tại Trung tâm nghiên cứu Vi sinh Môi trường, Bonn, CHLB
Đức
- Thời gian: Từ tháng 4/2015 đến tháng 9/2015 a) Thông tin về các dòng nấm được phân lập
- Nghiên cứu được thực hiện tại phịng thí nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu Vi sinh Môi trường, Bonn trong năm 2015. Dòng nấm Rhizomucor variabilis và Gongronella butleri được phân lập và tuyển chọn từ mẫu đất trồng lúa ở huyện Thạnh Phú, tỉnh Bến Tre. Nấm Rhizomucor variabilis và Gongronella butleri được đánh giá tăng nhanh khảnăng phân hủy chất hữu cơ
tốt nhất trong số 35 dòng nấm được phân lập và dã được kiểm tra an toàn sinh học tại Trung tâm Nghiên cứu Vi sinh Môi trường (UFZ) (Bảng 3.1). Trong
đó, dịng nấm Gongronella butleri có khả năng phân hủy chất hữu cơ khá cao
(41,7%) ở 14 ngày được ni cấy trong điều kiện phịng thí nghiệm.
- Bên cạnh khả năng phân hủy chất hữu cơ, dịng nấm Gongronella butleri có thể có khả năng đối kháng nấm gây bệnh, vì dịng nấm này có khả năng sản xuất Chitosan giữ vai trị trong phân hủy sinh học và là tác nhân đối
(Herrera-Eetrella and Chet, 1999; Kaur et al., 2012). Do đó, dịng nấm này
được đưa vào đánh giá khả năng đối kháng với nấm gây bệnh VLTR trên vườn cam.
Bảng 3.1: Đánh giá khả năng phân hủy rơm lúa trong điều kiện phịng thí
nghiệm sau 14 ngày ni cấy.
Tên dịng nấm Tổng hàm lượng CHC (mg) Khảnăng phân hủy Cellulose và Hemicellulose so với tổng hàm lượng CHC (%) Sinh khối nấm so với tổng hàm lượng CHC (%) Khảnăng phân hủy chất hữu cơ (% CHC) Rhizomucor variabilis 349 56,8 10,3 56,8 Gongronella butleri 349 40,7 8,7 41,7
* Đơn vị tính trong Bảng 3.1 được tính trên trọng lượng khơ kiệt của mẫu phân tích
3.5.2 Phân lập nấm Trichoderma từ vùng rễ cây cam Sành tiềm năng đối kháng nấm Fusarium solani
- Địa điểm: Tại Phịng thí nghiệm Vi sinh, Bộ môn Khoa học đất, Khoa
Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ
- Thời gian: Từ tháng 11/2015 đến tháng 5/2016
a) Phương tiện nghiên cứu
- Tổng số 20 mẫu đất được thu thập trên vùng rễ của 20 vườn cây cam Sành khỏe và không bị bệnh VLTR, đang giai đoạn mang trái ở độ sâu 0 - 20
cm, bên dưới tán cây, nơi bộ rễ phát triển nhiều nhất, mỗi gốc cây thu 4 mẫu đất, trộn thành một mẫu duy nhất.
- Môi trường Trichoderma-selective medium (TSM) cho phân lập nấm
Trichoderma sp. (Elad et al., 1981)
0,2g MgSO4.7H2O 1,18g K2HPO4.3H2O (K2HPO4 = 0.9g) 0,15g KCl 1,0g NH4NO3 3,0g Glucose 0,25g Cloramphenicol 5g Streptomycine 20g Agar
- Chất kháng khuẩn Cloramphenicol 0,025% (El-Mohamedy et al., 2012)
bổ sung vào môi trường cho phân lập nấm.
b) Phương pháp nghiên cứu
- Mẫu đất được trích bằng dung dịch Sodium pyrophosphat 0,2% (w/v) vô trùng với tỉ lệ 1:10 (Junghanns et al., 2008), pha lỗng dung dịch trích từ
10-1 đến 10-5 và hút 100 µL dung dịch pha lỗng chà lên đĩa mơi trường TSM
(có bổ sung kháng khuẩn cloramphenicol 0,025% và được điều chỉnh pH đến
5,5) được nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Phân lập nấm Trichoderma sp. ở 2-4
ngày sau khi nuôi cấy. Sau đó, các mẫu nấm được phân lập tiến hành tách
rịng trên mơi trường TSM.
c) Các chỉ tiêu ghi nhận
- Việc nhận dạng các dòng nấm Tricohderma sp . trên được xác định dựa
trên quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc kết hợp với quan sát dưới kính hiển vi xác định bào tử và sợi nấm theo bộ sưu tập loài của USDA (Farr and
Rosman, 2017).
- Các dòng nấm Trichoderma sp. được phân lập và lưu trữ trên môi trường PDA ở nhiệt độ 4oC cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.5.3 Đánh giá khả năng ức chế nấm gây bệnh vàng lá thối rễ của các dòng nấm được phân lập dòng nấm được phân lập
- Địa điểm: Tại Phịng thí nghiệm Vi sinh, Bộ môn Khoa học đất, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ
- Thời gian: Từ tháng 11/2015 đến tháng 5/2016 a) Phương tiện nghiên cứu
- Dòng nấm Fusarium solani được phân lập từ vùng rễ cây cam, xác định tác nhân gây bệnh vàng lá thối rễ vườn cam Sành.
- Dòng nấm Trichoderma sp. được phân lập từ vùng rễ cây cam (19 dòng nấm)
- Dòng nấm Gongronella butleri được phân lập từ đất trồng lúa
- Môi trường Malt extract agar (MEA) 1% thực hiện nuôi cấy để đánh
giá khả năng ức chế sự phát triển của các dòng nấm (Royse and Ries, 1978). - Chất kháng khuẩn streptomycin 0,5% và cloramphenicol 0,025% (El- Mohamedy et al., 2012) được bổ sung vào môi trường MEA 1%.
b) Phương pháp nghiên cứu
- Đánh giá khả năng ức chế của các dòng nấm được phân lập
(Trichoderma sp. và Gongronella butleri) đối với nấm Fusarium solani được thực hiện trong điều kiện phịng thí nghiệm (Whipps, 1987; Royse and Ries,
1978; Chand and Logan, 1984). Những dòng nấm tiềm năng ức chế và dòng nấm Fusarium solani được nuôi cấy trên mơi trường MEA 1% trước đó để
làm nguồn cho thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế.
- Sử dụng môi trường MEA 1% (có bổ sung chất kháng khuẩn Cloramphenicol 0,025% và Streptomycin 0,5%) cho đánh giá sự ức chế dòng nấm Fusarium solani. Đặt mỗi hai khối agar (đường kính 5 mm) có chứa
dịng nấm tiềm năng ức chế lần lượt với dòng nấm gây bệnh Fusarium solani
trên môi trường nuôi cấy MEA 1%. Mỗi khối agar chứa nấm có kích thước 0.25 cm2. Vị trí đặt khối 2 agar cách nhau 4 cm trên đĩa petri, mỗi khối agar
cách rìa đĩa 2.5 cm (đường kính đĩa Petri 9 cm) (Hình 3.1). Mỗi sự kết hợp được thực hiện với 4 lần lặp lại. Sau đó, những đĩa agar chứa nấm được ni cấy ở nhiệt độ phịng, trong điều kiện tối. Sự phát triển các dòng nấm được ghi nhận ở tất cả các ngày sau khi nuôi cấy và được theo dõi trong 04 tuần (Suciatmih and Rahmansyah, 2013; Chand and Logan, 1984; Skidmore and Dickinson, 1976).
c) Chỉ tiêu theo dõi
- Đánh giá giới hạn phát triển của loài gây bệnh bằng chỉ số phần trăm giới hạn sự phát triển được tính theo cơng thức của Royse and Ries (1978) Ở giai đoạn 2, 6 và 12 ngày sau khi ni cấy.
[100 x (r1-r2)/r1] - Trong đó:
r1: Khoảng cách sợi nấm phát triển xa nhất đối với dòng gây bệnh
r2: Khoảng cách giữa hai dòng nấm theo đường thẳng 2 khối agar đối diện nhau.
Hình 3.2: Đánh giá khả năng ức chế hai dòng nấm theo phương pháp
dual-culture trên đĩa petri Vi sinh vật
đối kháng
Vi sinh vật gây bệnh