Mẫu thực vật thu được đem về giám định tên khoa học và phân tích trong phòng thí nghiệm.
3.2.2.1. Xác định tên khoa học của các mẫu thực vật
Chúng tôi sử dụng khoá phân loại hiện hành của các tác giả Nguyễn Tiến Bân và cộng sự (2001, 2003, 2005), [8], Lê Khả Kế (1969, 1975), [17], Phạm Hoàng Hộ (1993), [16] và một số tài liệu liên quan đến phân loại thực vật.
3.2.2.2. Nghiên cứu năng suất
Theo phương pháp của Hoàng Chung (2008), [12]. Chúng tôi cắt phần ở trên mặt đất mà gia súc có thể sử dụng được tại mỗi điểm nghiên cứu. Mẫu mang về phòng thí nghiệm khoa Sinh – ĐHSP Thái Nguyên được phân thành hai phần: phần tươi và phần chết. Phần tươi được phân chia theo các nhóm: Hoà thảo, Xa thảo, cây Họ đậu, cây thuộc thảo, cây gỗ, cây bụi, dương xỉ… sau đó sấy khô ở nhiệt độ 1050C trong thời gian 10 giờ, cân và tính giá trị trung bình. Phần khô và phần chưa hoàn toàn mục nằm trên mặt đất thuộc phần chết chung cũng được sấy khô và cân .
3.2.2.3. Xác định dạng sống
Chúng tôi mô tả dạng sống của từng loài theo phương pháp của Hoàng Chung (2004), [11]
3.2.2.4. Đánh giá chất lượng cỏ
Chúng tôi lấy lá bánh tẻ của một số loài cỏ ưu thế của từng điểm nghiên cứu, tiến hành phân tích các chỉ tiêu nước, vật chất khô, prôtêin, đường, lipit và chất xơ tại Viện Khoa học sự sống - Đại học Nông lâm Thái Nguyên.
a. Xác định lượng vật chất khô trong cỏ [9]
- Nội dung:
Sấy mẫu ở nhiệt độ 1050C đến khi khối lượng mẫu không đổi và xác định sự thay đổi khối lượng trong quá trình sấy.
- Dụng cụ:
+ Cân phân tích với độ chính xác đến ± 0,0001 gam. + Tủ sấy điều chỉnh được nhiệt độ ± 10C.
+ Hộp nhôm + nắp có đường kính 65 mm, cao 30 mm. + Bình hút ẩm có chứa chất hút ẩm.
- Các bƣớc tiến hành:
Sấy hộp nhôm và nắp ở nhiệt độ 1050C trong vòng 30 phút, sau đó để nguội trong bình hút ẩm cân chính xác đến 0,0001 g.
Mẫu cỏ sau khi mang về phòng thí nghiệm được cân tươi cả túi nilông, lấy cỏ ra phơi khô không khí trong phòng thí nghiệm. Sau một số ngày cân lại, với 3 lần cân có trọng lượng không đổi gọi là khô không khí, trọng lượng tươi của cỏ sẽ là trọng lượng lần đầu trừ trọng lượng túi nilông. Cỏ tươi trừ cỏ khô sẽ là lượng nước mất đi.
Cân vào hộp nhôm 5g mẫu ở trạng thái khô không khí với độ chính xác 0,0001g. Mở nắp hộp nhôm, đặt nắp xuống đáy của hộp sau đó cho vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 1050C trong vòng 4 giờ tính từ khi nhiệt độ của tủ sấy đạt 1050C. Sau khi sấy 4 giờ, chúng ta đậy nắp hộp nhôm lại sau đó lấy ra cho vào bình hút ẩm. Sau khi để nguội đem cân bằng cân phân tích. Khối lượng hao hụt sau khi sấy được coi là lượng nước, phần còn lại sau khi sấy kiệt gọi là lượng vật chất khô.
- Tính toán lƣợng vật chất khô trong mẫu phân tích (S): Đƣợc tính
theo công thức phần trăm (%):
S = m1 x100 (3.1)
m
Trong đó: S là lượng vật chất khô trong mẫu (%). m1 là khối lượng mẫu sau khi sấy ở 1050C. m là khối lượng mẫu trước khi sấy ở 1050C.
b. Xác định hàm lượng nước trong cỏ
Hàm lượng nước = 100% - vật chất khô (%)
c. Phương pháp phân tích hàm lượng chất xơ theo Heenerberg- Stohmann [9]
Chất xơ được coi là tổng hợp của nhiều chất như xenluloz, hemixenluloz, các chất pectin, lignin. Việc định nghĩa chất xơ không dễ dàng, mà thường được coi là các chất còn lại sau quá trình thuỷ phân.
Chất xơ thô là phần còn lại của các nguyên liệu có nguồn gốc thực vật sau quá trình thuỷ phân bằng axit sunfuric và dung dịch natrihiđrôxit.
Chất xơ thực phẩm là phần còn lại của các tế bào thực vật được phân huỷ bằng các men tiết ra từ các tuyến tiêu hoá. Đó là hỗn hợp xenluloz, hemixenluloz và lignin.
Việc phân tích chất xơ là một phương pháp cổ điển nhưng luôn luôn là vấn đề cần được thảo luận thấu đáo. Do quá trình thuỷ phân hoá học các chất trong mẫu phân tích luôn luôn cần một môi trường càng chính xác bao nhiêu càng cho kết quả chính xác bấy nhiêu.
Từ quan điểm trên việc phân tích chất xơ có thể được tiến hành theo hai cách: Phương pháp hoá học và phương pháp sử dụng enzim. Trong đó phương pháp phân tích hóa học dùng để phân tích chất xơ là một trong những phương pháp cổ điển nhất của phương pháp phân tích thành phần hóa học có trong thức ăn. Bản chất của phương pháp này xuất phát từ quá trình thuỷ phân các chất của tế bào thực vật.
- Hoá chất:
+ Dung dịch Axit sunfuric (H2SO4) 0,255 ± 0,005 N. + Dung dịch Natrihiđroxit (NaOH) 0,313 ± 0,005 N. + Acetone.
+ Thiết bị phân tích xơ ANKOM 200/220. + Túi lọc: Sử dụng túi lọc ANKOM F57.
+ Dụng cụ hàn miệng túi: yêu cầu có nhiệt độ cao đủ để làm chảy nhựa polime trong túi lọc (số hiệu # 1915).
+ Tủ sấy.
- Các bƣớc tiến hành:
+ Đánh dấu túi lọc bằng bút không bị xoá trong dung môi. Cân túi lọc (ghi W1.1) sau đó chỉnh cân về không (ấn phím TARE).
+ Túi đối chứng: Cân ít nhất một túi không và cho vào cùng phân tích (ghi W1.2), điều này cho phép xác định sai số xảy ra đối với độ ẩm và khối lượng của túi.
+ Cân khoảng 1g mẫu cho thẳng vào túi lọc (ghi W2). Mẫu cân phải cho sát đáy túi.
+ Hàn miệng túi khoảng 4mm tính từ miệng túi bằng dụng cụ hàn túi. Dàn đều mẫu trong túi bằng lắc hoặc gõ túi. Tránh không để mẫu gần phần hàn miệng túi (trong phạm vi 4mm).
+ Đặt tối đa 24 túi vào khay chứa túi của máy ANKOM. Sử dụng tất cả 9 khay mà không quan tâm đến số túi phân tích. Đặt 3 túi vào một khay và xếp các khay vào trục đứng, mỗi cái lệch nhau một góc là 1200. Đặt cả trục chứa các khay mẫu vào buồng phân tích, đặt khối sắt hình trụ lên khay thứ 9 không chứa mẫu để dìm toàn bộ khay xuống.
+ Khi phân tích 24 túi lọc , đổ vào đó 1.900 – 2.000 ml dung dịch axit có nhiệt độ ổn định cho đến khi ngập túi lọc. Nếu phân tích ít hơn 20 túi, cho theo tỉ lệ 100ml axit/ 1túi (tối thiểu phải có 1.500 ml).
+ Công phá 40 phút bằng dung dịch axit sufuric (H2SO4) 0,255 ± 0,005 N, sau đó rửa nước cất 2 lần (mỗi lần 5 phút).
+ Công phá 40 phút bằng dung dịch Natrihiđroxit (NaOH) 0,313 ± 0,005 N, sau đó rửa bằng nước cất tất cả 3 lần.
+ Tháo túi lọc khỏi khay, bóp nhẹ cho bớt nước thừa. Cho túi vào cốc thuỷ tinh thể tích 250 ml, cho thêm acetone ngập túi. Ngâm khoảng 3 – 5 phút, lấy túi mẫu ra, nhẹ nhàng bóp để rút bớt acetone.
+ Trải đều túi lọc để khô không khí. Cho vào tủ sấy đặt nhiệt độ 1050C, sấy trong vòng 2 – 4 giờ.
( Chú ý: Không cho túi lọc vào tủ sấy trước khi acetone khô hết). + Sau khi sấy khô, lấy túi lọc ra cho vào bình hút ẩm. Để nguội và cân (ghi W3). Tính lượng xơ và khoáng của mẫu bằng công thức W4:
W4 = W3 – W1.1
+ Đưa cả túi đối chứng và túi chứa mẫu vào đốt trong lò nung ở nhiệt độ 5500
C trong vòng 2 giờ, để nguội trong bình hút ẩm và cân (ghi W5.1 là khối lượng chén + khoáng của mẫu, W5.2 là khối lượng chén + bao đối chứng sau đốt).
Tính lượng khoáng thực sự của mẫu như sau: W5 = (W5.1 – WCM) – ( W5.2 – WCM)
Trong đó: WCM là khối lượng chén dùng đốt mẫu.
WCM là khối lượng chén dùng đốt bao đối chứng.
- Tính toán kết quả:
Hàm lượng xơ thô tính bằng % theo công thức sau:
X = W4 - W5 x 100 (3.2)
W2
Trong đó: X: hàm lượng xơ thô (%)
W2: Khối lượng mẫu phân tích tính bằng gam
W4: Khối lượng chất xơ + khoáng sau khi lọc ete, axit, bazơ và acetone.
d. Phân tích hàm lượng Protein thô theo phương pháp MicroKjeldanl [9]:
- Nguyên lý:
Trong phương pháp MicroKjeldanl người ta vô cơ hoá mẫu bằng
H2SO4 98% kết hợp với chất xúc tác để chuyển nitơ hữu cơ ra dạng (NH-
4)2SO4 rồi dùng NaOH để đẩy NH3 ra khỏi muối Amoni, NH3 sau khi được giải phóng ra sẽ được cuốn đi bằng dòng hơi nước nóng. Sau khi được làm nguội sẽ được hấp thụ vào dung dịch H3BO3 ở trong bình hứng tạo ra muối borat amon có màu xanh trong.
(NH4)2SO4 + 2NaOH = 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O 3NH3 + H3BO3 = (NH4)3BO3
Để xác định được lượng amoniac giải phoáng ra trong quá trình chưng cất ta đem đi chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,1N đến khi nào dung dịch chuyển sang màu tím nhạt là được.
2(NH4)3BO3 + 3H2SO4 → 3(NH4)2SO4 + 2H3BO3
Từ lượng axit H2SO4 0,1N tiêu tốn trong quá trình chuẩn độ chúng ta tính được lượng nitơ có trong mẫu.
- Dụng cụ:
Ống công phá mẫu; Bình tam giác 300 ml
- Hoá chất:
H2SO4 đậm đặc 98%; Viên xúc tác Kjeldahl (hỗn hợp Cu và Se); H2SO4 0,1N; NaOH 33%; H3BO3 4% cùng với chất chỉ thị màu Tashio (gồm hỗn hợp xanh Methylen và đỏ Methylen); nước cất.
- Cách tiến hành:
Giai đoạn công phá mẫu:
+ Bƣớc 1: Cân mẫu:
Mẫu được sấy khô ở nhiệt độ 50 – 600C, sau đó nghiền nhỏ.
Tiến hành: Cân chính xác và cẩn thận bằng cân phân tích (có độ chính xác 0,0001) 1 - 1,5 g mẫu cho vào bình công phá (trước khi cho mẫu đã cân
vào ống thì ta phải cho một viên xúc tác trước), sau đó cho vào 10 ml H2SO4
đậm đặc, bịt chặt ống đốt mẫu bằng giấy thiếc và ngâm qua đêm.
Chú ý: Để tăng độ chính xác khi phân tích, chúng ta phải bố trí một ống Kjeldahl đối chứng chỉ có chất xúc tác và 10 ml H2SO4 đậm đặc mà không có mẫu phân tích, tiến hành tất cả các bước như mẫu phân tích thật.
+ Bƣớc 2: Công phá mẫu:
Nhiệt độ cần cho quá trình công phá là 3800C, thời gian công phá là 40 phút. Khi quá trình công phá đã được ta đợi nhiệt độ của ống Kjeldahl hạ xuống bằng nhiệt độ môi trường rồi đưa vào chưng cất.
Giai đoạn chưng cất và phân tách amoniac sau khi công phá:
Sau khi công phá xong ta tiến hành chưng cất trên máy cất đạm tự động Gerhardt. Máy tự động hút dung dịch NaOH, H3BO3 và nước cất. Thời gian chưng cất là 5 phút, dung dịch sau chưng cất có màu xanh.
Giai đoạn xác định lượng amoniac giải phóng ra sau quá trình chưng cất: Để xác định được lượng amoniac giải phóng ra trong quá trình chưng cất ta đem đi chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,1N đến khi nào dung dịch chuyển sang màu tím nhạt là được, từ lượng axit H2SO4 0,1N tiêu tốn trong quá trình chuẩn độ chúng ta tính được lượng đạm có trong mẫu.
- Tính kết quả: Dựa trên lượng axit H2SO4 0,1N tính ra hàm lượng prôtêin có trong mẫu.
e. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp
Bertrand[9]:
- Nguyên tắc:
Đường khử do trong cấu trúc có nhóm aldehit có tính khử mạnh nên có khả năng tham gia phản ứng tráng bạc và phản ứng với dung dịch Fehlinh.
R – CHO + 2AgNO3 + 3NH3 + H2O → R – COONH4 + 2NH4NO3 + 2Ag↓ R – CHO + 2Cu(OH)2 → R – COOH + Cu2O↓ + 2H2O
Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 → 2 CuSO4 + 2FeSO4 + H2O
10FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 → K2SO4 + 2MnSO4 + 5Fe2(SO4)3 + 8H2O
Khi dùng dung dịch chuẩn KMnO4 0,1N để chuẩn độ lượng FeSO4 tạo thành, từ thể tích tiêu tốn khi tra bảng sẽ tìm được số mg đường khử và áp dụng công thức ta sẽ tìm được hàm lượng đường hay tinh bột trong mẫu.
- Cách tiến hành:
Công đoạn chiết, tách và thuỷ phân: Cân một lượng mẫu cỏ sao cho
khi pha xong có hàm lượng từ 4 – 10% đường. Mẫu cỏ được cắt nhỏ rồi nghiền mịn, sau đó thêm vào khoảng 50ml nước, đun cách thuỷ ở 800C trong 15 phút, để nguội khử tạp chất rồi định mức đến thể tích cần thiết (100 – 150 ml) cả bã, lọc lấy dịch trong. Dung dịch này chỉ phân tích được hàm lượng đường khử (monosaccarit).
Tiến hành phân tích: Lấy 10ml dung dịch Fehlinh A và 10 ml dung
dịch Fehlinh B cho vào cốc có dung tích 250cc, đun sôi, thêm 10ml dung dịch phân tích và khoảng 20ml nước sôi. Dung dịch phía trên phải có màu xanh, nếu không phải làm lại với lượng dịch lọc ít hơn. Nhưng tổng thể tích dung dịch cuối cùng trong cốc phải bằng 50ml. Sau lọc kết tủa qua phễu , giữ kết tủa trong cốc, tráng bằng nước cất sôi một vài lần, sao cho hết màu xanh trên phễu lọc, hoà tan tủa trong cốc bằng 30ml dung dịch Fe 2(SO4)3. Lấy bình hứng ra và chuẩn độ bằng dung dịch KMnO4 0,1N, đến khi xuất hiện màu hồng.
* Hàm lượng đường khử được tính theo công thức:
X (%) = V .G.100
10.A.100 (3.3)
Trong đó: X là hàm lượng đường khử có trong mẫu (%). V: thể tích dung dịch pha ban đầu
G: mg glucoza A: số gam mẫu cân
10: số ml dung dịch đem phân tích 1000: hệ số chuyển đổi mg sang gam.
3.2.2.5. Phân tích mẫu đất
- Xác định độ ẩm của đất theo phương pháp sấy khô tuyệt đối: Đất tươi
sau khi đã được làm khô không khí (phương pháp như làm cỏ khô). Cân 100g đất đã hong khô không khí và rây qua rây 1mm cho vào hộp nhôm (mở nắp), sấy trong tủ sấy ở 1050C đến trạng thái không đổi trong thời gian 12 giờ đồng hồ, tiến hành lặp lại 3 lần. Sau khi sấy xong, đậy nắp hộp nhôm, cho vào bình hút ẩm (đáy bình chứa CaCl2 hoặc xilicagen) để hạ nhiệt độ cùng với nhiệt độ trong phòng, thông thường để nguội từ 20 – 30 phút, sau đó cân trọng lượng đất khô tuyệt đối và so sánh với khối lượng ban đầu.
- Xác định độ pH (pH(KCl)) theo phương pháp đo bằng máy pHmeter:
Cho vào bình thuỷ tinh 5 gam đất đã qua rây 1mm, sau đó thêm vào 25ml KCl (1N), lắc trong 10 phút rồi ngâm qua đêm, lắc lại và đo trên máy Meter, đọc trị số pH ở trên máy.
- Xác định hàm lượng mùn (%) theo phương pháp Tiurin: Cân 0,2 ga m
đất đã qua rây 0,25mm cho vào bình tam giác 100ml, sau đó thêm 5ml dung dịch K2Cr2O7 (0,4N) lắc nhẹ, cắm phễu con trên miệng bình để ngưng lạnh. Sau đó đặt bình trong nồi Parafin, đun sôi dung dịch trong 5 phút ở nhiệt độ 1700C - 1800C trên bếp điện cho đến khi dung dịch không còn mầu xanh. Để nguội dung dịch rồi đổ vào bình tam giác, dùng nước cất để tráng phễu, bình từ 2 – 3 lần và đổ vào bình tam giác. Thêm 1ml H3PO4 và 8 giọt chỉ thị màu Fenylantranyn, sau đó dùng dung dịch muối Mo chuẩn độ lượng Kali bicromat thừa đến lúc dung dịch biến đổi sang màu xanh và tính kết quả.
Để xác định hàm lượng đạm, lân, kali cần phải qua giai đoạn công phá mẫu: Cân 1 gam đất đã rây qua rây 1mm cho vào bình thuỷ tinh dung tích
50ml. Thêm vào bình một ít nước cất để mẫu đất hơi ẩm, rồi cho vào 8ml H2SO4 đặc , lắc đều, cho vào thêm 10 giọt HClO4 70%. Đậy bình bằng một chiếc phễu nhỏ, đun từ từ cho nhiệt độ tăng dần. Khi dung dịch bắt đầu chuyển thành màu trắng thì tiếp tục đun thêm 20 phút nữa. Toàn bộ thời gian công phá mẫu hết khoảng 30 – 40 phút. Sau đó nhấc xuống để nguội cho vào 3 giọt HClO4 và đun cho trắng màu.
- Xác định hàm lượng đạm tổng số (N%) theo phương pháp Kjeldahl:
Đem mẫu đất đã được công phá chưng cất Kjeldahl với thời gian 20 – 30 phút, thu được dung dịch màu tím đỏ chuyển sang màu lục và tính kết quả.
- Xác định hàm lượng lân tổng số (P2O5%) theo phương pháp quang
phổ hấp phụ: Lấy 5ml dung dịch mẫu sau khi công phá cho vào bình thuỷ
tinh, chỉnh độ pH cho đến 7 bằng dung dịch NaOH 10%, sau đó thêm 10ml dung dịch H2SO4 5N, thêm 1,25ml dung dịch Amonimolipdat 2% và 3ml dung dịch axit ascobic 1N. Đun cách thuỷ trên bếp khi cường độ màu lớn