4. đối tượng và phạm vi nghiên cứu của ựề tàị
1.2.1. Nghiên cứu ở ngoài nước
1.2.1.1. Phân loại thực vật học rau bản ựịa hoang dại
Phân loại học thực vật là một phần của thực vật học, chuyên nghiên cứu việc sắp xếp các thực vật giống nhau thành từng nhóm theo một trật tự tự nhiên, gọi là hệ thống. Việc phân loại các cây cối, làm sáng tỏ mối quan hệ thân thuộc giữa chúng, không những có tầm quan trọng về mặt lý thuyết mà còn có ý nghĩa thực tiễn rất lớn, góp phần vào việc cải tạo, sử dụng những cây có lợi, hạn chế hoặc tiêu diệt những cây có hạị Phân loại học thực vật là cơ sở chủ yếu của các nghiên cứu sinh học về thực vật (sinh thái, tài nguyên thực vật, di truyền chọn giống, sinh lý, sinh hóaẦ). Nhờ có phân loại học chúng ta hiểu ựược tắnh ựa dạng của sự sống, nghĩa là sự khác biệt giữa các sinh vật ựược xuất hiện do kết quả của sự tiến hóa thắch nghị Phân loại học vì vậy là một trong những nhánh có lợi ắch nhất của khoa học Sinh vật (Nguyễn Nghĩa Thìn, 1997) [32]
Các phương pháp phân loại ựều dựa trên nguyên tắc sau: Những thực vật có chung nguồn gốc thì có những tắnh chất giống nhaụ Thực vật càng gần nhau chừng nào thì tắnh chất giống nhau càng nhiều chừng ấỵ Sự giống nhau có thể về ựặc ựiểm hình thái, giải phẫu, sinh lý, sinh hóa, phôi sinh học. Do ựó có nhiều phương pháp phân loại khác nhau:
Phương pháp hình thái so sánh: Dựa vào các ựặc ựiểm hình thái nhất là hình thái cơ quan sinh sản. Những thực vật càng gần nhau thì càng có nhiều ựặc ựiểm hình thái giống nhaụ Hiện nay ngoài những ựặc ựiểm hình thái bên ngoài người ta còn dùng cả những ựặc ựiểm về cấu trúc tế bào, của mô, kể cả cấu trúc siêu hiển vi ựể phân loạị
Phương pháp cổ thực vật học: Dựa vào các mẫu hóa ựá của thực vật ựể tìm quan hệ thân thuộc và nguồn gốc của các nhóm mà các khâu trung gian hiện nay không còn nữạ Những nghiên cứu về bào tử và phấn hoa, ựặc biệt di tắch của phấn hoa trong các thời ựại ựịa chất ựã giúp xác ựịnh thành công quan hệ họ hàng của một số thực vật và góp phần vào việc xây dựng hệ thống chủng loại phát sinh.
Phương pháp hóa sinh học: Các loài gần nhau thường chứa những hợp chất hóa học giống nhau, phương pháp này có ý nghĩa thực tiễn rất lớn, nó cho ta hướng tìm những hợp chất cần thiết trong các loài gần gũi nhaụ
Phương pháp ựịa lý học: Mỗi chi, mỗi loài thực vật trên thế giới ựều có một khu vực phân bố nhất ựịnh. Nghiên cứu khu vực phân bố của thực vật người ta có thể xác ựịnh ựược quan hệ thân thuộc.
Phương pháp cá thể phát triển: Dựa trên quy luật của của phát triển cá thể: Trong quá trình phát triển, mỗi cá thể ựều lặp lại những giai ựoạn/những hình thức chủ yếu mà tổ tiên nó ựã trải quạ Theo dõi quá trình phát triển lịch sử của cây ựể xét ựoán quan hệ nguồn gốc của nó.
Phương pháp miễn dịch: Tắnh miễn dịch là tắnh không cảm thụ của cơ thể ựối với một bệnh này hay một bệnh khác. Tắnh miễn dịch ở một mức nào ựó ựược kế thừa ở các thế hệ và là ựặc ựiểm của một họ hay một chi nhất ựịnh.
Phương pháp chẩn ựoán huyết thanh: Dựa trên phản ứng máu của ựộng vật máu nóng ựối với những chất ngoại laị Kết quả thu ựược của những phản ứng giống nhau trên cơ thể một ựộng vật nào ựó cho phép ta xác ựịnh mối quan hệ thân thuộc của các loài thực vật thử nghiệm.
Ngày nay với sự phát triển của Công nghệ sinh học còn có phương pháp tế bào học bao gồm cả phương pháp di truyền. Kết hợp cả sử dụng hình thái và số lượng nhiễm sắc thể của tế bào, hiện tượng ựa bội thể, di truyền quần thể ựang
ựược sử dụng rộng rãi vào phân loại thực vật học và mang lại những dẫn liệu chắnh xác và ựáng tin cậy hơn.
Phân loại bằng nhiễm sắc thể (Cytotaxonomy): Phân tắch thể nhiễm sắc ựơn giản nhất là sử dụng phương pháp ép ựỉnh sinh trưởng của rễ cây mầm. Bao gồm các bước: Gieo hạt trong ựĩa petry cho nảy mầm, lấy ựỉnh rễ 1cm; cố ựịnh mẫu và nhuộm; quan sát và ựếm số thể nhiễm sắc dưới kắnh hiển vi; vẽ bản ựồ kiểu nhân.
Phân loại bằng sinh hóa (Chemotaxonomy):Dựa trên sự phân tắch các sản phẩm sinh hóa, chủ yếu ựiện di protein hay enzyme, hay còn gọi là phân tắch ựẳng men (isozyme). Nguyên tắc của phương pháp này xem xét sự có mặt của các alen trên thể nhiễm sắc, tức là xem xét các nhân tố di truyền thông qua các sản phẩm của nó là protein. Bởi vì mỗi protein ựược tạo ra phải do 1 hay 1 hệ các alen ựiều khiển và kiểm trạ Sự có mặt của các protein nào ựó mà ựại diện là các enzyme chứng tỏ sự có mặt của các alen ựó trong bộ thể nhiễm sắc.
Phương pháp ựánh dấu phân tử : Chỉ thị phân tử là bất kỳ ựoạn DNA nào ựược dùng ựể phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc giống khác nhau, ựều có thể ựược xem là chỉ thị DNẠ Hiện nay có rất nhiều cách ựánh dấu phân tử như sự ựa hình về các isozyme, protein, và ADN ựược sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền và chọn giống.
Tuy nhiên cần lưu ý rằng, trong thực tế phân loại không chỉ dựa vào 1-2 phương pháp mà phải dùng nhiều phương pháp khác nhau ựể giải quyết, như vậy những kết luận mới chắnh xác
để quản lý ựược tài nguyên di truyền thực vật phải hiểu rõ, nắm vững và chắnh xác hệ thống phân loại thực vật. Trong ựó loài (Species) là ựơn vị phân loại cơ bản của sinh vật nói chung và của cây trồng, nói riêng. Nguyên tắc phân loại: dựa trên các ựơn vị phân loại là taxa (số ắt: Taxon). Theo Võ Văn Chi, 2007, những nhóm phân loại thuộc về tất cả các bậc ựược coi là taxa (số ắt:
taxon). Các bậc chắnh theo ựiều khoản 3 trong Pháp lệnh giống cây trồng gồm: Giới thực vật (Regnum); Ngành (divisio, phylum); Lớp (Classis); Bộ (Ordo); Họ (Familia); Chi (Genus); Loài (Species); Thứ/giống (varieties)
Có thể nói, công tác phân loại thực vật các loài cây có ắch ựã biết nói chung và rau bản ựịa nói riêng trên thế giới ựã ựạt ựược nhiều kết quả, ựóng góp quan trọng vào hoạt ựộng phân biệt các loài, giống ựể có thể tác ựộng phù hợp trong quá trình bảo tồn và phát triển chúng. Hiện nay một số dữ liệu phân loại thực vật có uy tắn và khá ựầy ựủ là Dữ liệu thực vật Hoa Kỳ (USDA plant data, 2010) [58], Dữ liệu thực vật Vân Nam, Trung Quốc.(Ramesh, B. R., 2011) [55]; dữ liệu thực vật của Úc và của Ấn độ cũng rất dễ truy cập ựể so sánh phân loại thực vật các loài cây nghiên cứụ
1.2.1.2. Cơ sở khoa học và một số nghiên cứu về nhân giống
Theo cuốn Hướng dẫn bảo tồn thực vật có ắch của WHO, IUCN và WWF, nhân giống thực vật có ắch là một hoạt ựộng quan trọng trong công tác bảo tồn, nhằm tạo giống thực vật có ắch phục vụ hoạt ựộng trồng trọt, bảo tồn chuyển vị, bảo tồn nguyên vị, phục tráng thực vật có ắch... (WHO-IUCN-WWF (1993) [59]. Nhân giống sinh dưỡng (vô tắnh) là phương pháp dựa trên cơ sở của phân bào nguyên nhiễm là cách phân bào truyền ựạt chắnh xác ựặc ựiểm di truyền từ ựời trước cho ựời saụ Nhân giống sinh dưỡng bao gồm chiết, ghép, nhân hom và nuôi cấy mô tế bàọ Nhân giống bằng hom (Cutting propagation) là phương pháp nhân giống sinh dưỡng với hom là một ựoạn thân, cành, rễ ựược ựặt trong môi trường thắch hợp sẽ phát triển rễ bất ựịnh và mọc thành cây ựộc lập. đây là một hình thức nhân giống sinh dưỡng, dựa trên khả năng sinh sản sinh dưỡng của cây, trên cơ sở phân bào nguyên nhiễm. Tế bào mẹ sinh ra tế bào con có bộ nhiễm sắc thể giống hệt mình. Do vậy sinh sản sinh dưỡng duy trì ựược các ựặc tắnh di truyền của cơ thể mẹ và ổn ựịnh qua nhiều thế hệ. Phương pháp này ựược
áp dụng ựể duy trì các kiểu gen quan trọng của cây mẹ (Trần Cự, đỗ đình Tiến, 2000; Etelka L and Jane G.,1998) [10] [47].
Cơ sở tế bào học của sự hình thành rễ bất ựịnh là tại ựiểm hom bị phá hủy, bị tổn thương và các tế bào dẫn truyền của mô gỗ ựược mở ra làm gián ựoạn các chu trình trao ựổi chất, vận chuyển chất trong thân dẫn ựến dòng nhựa luyện ựược dẫn từ phần lá còn lại xuống dây bị dồn nén lại khiến cho các tế bào phân chia thành mô sẹọ đây chắnh là cơ sở cho sự hình thành rễ bất ựịnh. Quá trình tái sinh rễ ựược hình thành qua 3 bước:
Bước 1. Các tế bào ở mặt ngoài chỗ cắt sẽ bị thối, hình thành lớp keo lấp ựầy các mạch gỗ giúp hạn chế thoát hơi nước tại chỗ bị cắt.
Bước 2. Các tế bào sống ngay dưới lớp tế bào bảo vệ ựó bắt ựầu phân chia sau khi vết cắt ựược vài ngày và có thể hình thành một lớp mô mềm.
Bước 3. Các tế bào lân cận vùng tượng tầng, mạch và libe bắt ựầu hình thành rễ bất ựịnh. Cây gỗ có một hoặc nhiều lớp mô gỗ thứ cấp và libe thì rễ bất ựịnh thường phát sinh ở các tế bào nhu mô còn sống của hom, bắt nguồn từ phần libe thứ cấp còn non. Tuy nhiên ựôi khi rễ bất ựịnh cũng phát sinh từ mạch rây, tượng tầng, libe, bì khổng, tủỵ
Nói chung các rễ bất ựịnh thường ựược hình thành bên cạnh và sát vào lõi trung tâm của mô mạch, ăn sâu vào trong thân cành tới gần ống mạch, sát bên ngoàị Thời gian hình thành rễ của hom giâm ở các loài khác nhau biến ựộng rất lớn từ vài ngày với các loài dễ hình thành rễ và tới vài tháng ựối với loài khó ra rễ. Những nhân tố nội sinh có ảnh hưởng tới khả năng ra rễ là ựặc ựiểm di truyền của loài, của xuất sứ và của cá thể, vai trò của tuổi cây, tuổi cành, vị trắ cành, pha phát triển của cành, số lá/cành, kắch thước hom và các chất ựiều hòa sinh trưởng. Một số nhân tố ngoại sinh như các loại hóa chất kắch thắch ra rễ, giá thể giam hom, thời tiết, khắ hậu như ẩm ựộ, ánh sáng, nhiệt ựộ...
Theo khả năng giâm hom có thể chia thực vật thành 2 nhóm chắnh:
Nhóm sinh sản chủ yếu bằng hom cành, thuộc nhóm này là các loài cây thuộc họ Dâu tằm (Moraceae) như ựa, sung, dâu tằm... Một số loài thuộc họ liễu (Salcaceae), các loài cây nông nghiệp như sắn, mắa, khoai lang. đối với những loài cây này khi giâm hom không cần xử lý thuốc hom giâm vẫn ra rễ bình thường.
Nhóm sinh sản chủ yếu bằng hạt, khả năng ra rễ của hom hạn chế bởi các mức ựộ khác nhau như: Tuổi cây mẹ, chất kắch thắch, yếu tố môi trường.
Trong các chất ựiều hòa sinh trưởng, Auxin ựược coi là chất quan trọng nhất trong quá trình ra rễ của cây hom. Tuy nhiên nhiều chất khác tác ựộng cùng auxin và thay ựổi hoạt tắnh Auxin cũng tồn tại một cách tự nhiên trong các mô của hom giâm và tác ựộng ựến quá trình ra rễ, các chất kắch thắch và kìm hãm ra rễ [19]. Các chất kắch thắch và kìm hãm ra rễ ựều có thể tồn tại ở hầu hết thực vật. Tiềm năng ra rễ của hom giâm ựược xác ựịnh bằng nồng ựộ tương ựối của các chất nàỵ Các loài cây dễ ra rễ chứa nồng ựộ cao các chất kắch thắch ra rễ, còn các loài khó ra rễ lại chứa nồng ựộ cao các chất kìm hãm ra rễ.
Tình hình nghiên cứu nhân giống cây LSNG
Trên thế giới, nhân giống bằng hom ựã ựược các nhà làm vườn và trồng cây cảnh sử dụng từ lâu ựời và áp dụng trong sản xuất nông lâm nghiệp cách ựây hàng trăm năm, ựược nghiên cứu ở các nước trên thế giới như Liên Xô cũ, Trung Quốc, Thụy điển, Australia, Pháp, Ấn độ, Malaysia, Indonesia, Nhật Bản, Công Gô... ựặc biệt từ khi con người tổng hợp ựược các chất ựiều hòa sinh trưởng nhân tạo (Lê Văn Tri 1994, 1997; Vũ Văn Vụ, 1993) [33],[34],[39]. Tại Liên Xô cũ người ta ựã tiến hành nhân giống bằng hom cách ựây gần 70 năm, ựã thắ nghiệm nhân giống của 260.000 hom của 240 loài cây trồng thuộc 55 họ, 111 chi trong ựó có 47 loài lá kim, 113 loài lá rộng cho các loài cây rừng, cây cảnh, cây thuốc và cây công nghiệp, cây ăn quả. Tại Thụy điển hàng năm, công ty Hylles Hog
sản xuất 4.000.000 cây hom Vân Sam. Tại Trung Quốc, chỉ riêng với sản xuất chế phẩm ABT, người ta ựã thực nghiệm 1.270 loài cây gỗ, cây ăn quả, cây hoa, cây công nghiệp... Riêng Quảng đông Trung Quốc có 4 xưởng sản xuất cây bằng hom, trong ựó có 3 xưởng cấp huyện, ựạt công xuất 1 triệu cây hom 1 năm [18]. Tại Malaysia, 75 loài cây họ Quả hai cánh ựã ựược nhân giống bằng hom. Tại Thái Lan, 1ha vườn giống Sao ựen 5 tuổi có thể sản xuất 200.000 cây hom ựủ trồng 400-500 ha rừng ( Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2001) [29].
1.2.1.3. Nghiên cứu ựặc ựiểm sinh học, sinh thái
Ngày nay, ước lượng có khoảng 35.000-70.000 loài trong số gần 270.000 loài thực vật bậc cao ựược sử dụng vào mục ựắch làm lương thực, thực phẩm, chăm sóc sức khỏe và chữa bệnh ở khắp nơi trên thế giới (WWF, 1993). Tuy nhiên hiện nay theo ước tắnh, có tới 1.000 loài ựang ựối mặt với nguy cơ tuyệt chủng trong ựó có khoảng 120 loài ở Ấn độ, 77 loài ở Trung Quốc, 75 loài ở Maroco, 61 loài ở Thái Lan, 35 loài ở BangladesẦ (dẫn theo Nguyễn Chắ Hiếu, 2011). Chắnh ựiều này ựã thúc ựẩy hoạt ựộng ựiều tra, kiểm kê thu thập và bảo tồn tài nguyên thực vật của nhiều quốc gia trên thế giới, ựặc biệt ở những nước phát triển như Hoa Kỳ, Úc, Nhật Bản và một số nước có tài nguyên thực vật phong phú như Trung Quốc, Ấn độ, MalaysiaẦ Cho tới nay, những loài thực vật có ắch cho con người ựược biết ựều ựược mô tả cơ bản về ựặc ựiểm sinh thái, hình thái chắnh. Các dữ liệu này ựều thuộc sự quản lý của các ngân hàng gen quốc gia (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Cs, 2012) [17].