Chương 2 .ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU
2.2. Nội dung nghiêncứu
2.2.2. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiêncứu
2.2.2.1. Kỹ thuật thăm khám lâm sàng cho bệnhnhi:
Triệu chứng lâm sàng được ghi nhận khi có ít nhất 2 bác sỹ chuyên ngành sơ sinh xác định, theo phác đồ chẩn đoán và điều trị của Chương trình đào tạo chuyên gia sơ sinh của Mạng lưới chăm sóc Bà mẹ và trẻ sơ sinh West Midlands 2019 [10].
2.2.2.2. Xác định các chỉ số huyếthọc
- Xét nghiệm đếm tế bào máu toàn bộ trong máu ngoại vi, đếm bạch cầu trong dịch não tủy được thực hiện tại khoa xét nghiệm huyếthọc.
- Qui trình kỹ thuật: Phê duyệt qui trình kỹ thuật chuẩnnăm 2019. - Phịng xét nghiệm đạt tiêu chuẩn ISO 15189 -2012.
- Máy móc, vật tư: Máy phân tích huyết học tự động ADVIA 2120 – Seimen. Hóa chất do hãng sản xuất cungcấp.
2.2.2.3. Xác định các chỉ số sinhhóa
- Xét nghiệm sinh hóa cơ bản trong máu như Na+, K+,glucose, CRP, GOT, GPT…
- Qui trình thực hiện đã được phê duyệt năm 2019. - Phòng xét nghiệm đạt tiêu chuẩn ISO 15189 -2012. - Máy móc, vật tư: Máy xét nghiệm sinh hóa tựđộng.
2.2.2.4. Xác định các chỉ số đơng máu:
- Xét nghiệm các chỉ số đông máu cơ bản: Prothrombin (PT), APTT, Fib - Máu được chống đông bằng Natricitrat 3,8%, ức chế ion calcium, sau đó cho thừa một lượng hóa chất hoạt hóa yếu tố đơng máu tạo cục đơng, dùng phương thức phát hiện ánh sáng tán xạ để đo thời gian đông máu huyết tương.
- Qui trình thực hiện đã được phê duyệt năm2019. - Phòng xét nghiệm đạt tiêu chuẩn ISO 15189 -2012. - Máy móc, vật tư: máy xét nghiệm đông máu.
2.2.2.5. Xác định các chỉ số miễn dịch nCD64, mHLA-DR, SI
Hóa chất:
- Dung dịch ly giải BD FACSLyse - Dung dịch rửa mẫu BD PBS
- Kháng thể: CD14 FITC, CD64/CD45 (PE/PerCP), HLA-DR/Mono (PE/PerCP), CD45 APC-H7
Trang thiết bị:
- Máy hệ thống máy BD FACS Canto II (6 màu) và Canto (10 màu) - Máy li tâm
- Pipette và đầu pipette loại 20µl, 200 µl và 1000µl - Máy lắc: Vortex mixer
- Ống BD 5 ml - Găng tay
Nguyên tắc/ nguyên lý của quy trình
- Để xác định các biểu hiện kháng nguyên CD64, HLA-DR trên tế bào BC trung tính và monocyte bằng kỹ thuật phân tích tế bào dịng chảy, người ta ủ mẫu máu với các kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang. Các kháng thể này sẽ gắn đặc hiệu với các kháng nguyên đặc trưng (CD) trên bề mặt của từng loại bạch cầu. Các tế bào BC đã gắn huỳnh quang sau đó được cho đi qua các chùm sáng laser trên hệ thống máy Flow-Cytometry BD FACS Canto. Dựa vào kích thước, đậm độ nhân, màu huỳnh quang để nhận diện và xác định hiển thị của dấu ấn.
- Thuốc thử QuantiBRITE PE được đóng gói dạng hạt đông khô được gắn kết với 4 nồng độ chất huỳnh quang khác nhau dùng để đo tín hiệu huỳnh quang trên kênh PE để tính tốn ra số lượng phân tử PE. Khi sử dụng các phân tử PE được gắn kết với kháng thể với một tỉ lệ đã biết trước, số lượng phân tử PE có thể chuyển đổi sang số lượng kháng thể gắn trên một tế bào.
Các bước thực hiện của quy trình
Bước Mơ tả
1 Quy trình nhuộm mẫu
1.1 Quy trình nhuộm mẫu: (Stain-Lyse-Wash)
- Lấy 50µl máu tồn phần vào ống BD Falcon, ghi tube 1, 2 - Thêm kháng thể tương ứng theo bảng sau vào các tube
- Trộn đều mẫu
- Ủ 30 phút, nhiệt độ phịng, bóng tối
- Thêm1 mL FACSLyse (1x)→ Ủ 15 phút, nhiệt độ phịng, bóng tối. - Ly tâm 2500 vòng/10phút → đổ phần trong giữ lại cặn BC
- Thêm 3ml PBS 1X. Ly tâm 2500 vòng/10phút→ đổ phần trong giữ lại cặn BC
-Cặn BC thêm 300µl PBS 1X→ Đếm mẫu trên hệ thống máy Canto 1.2 Quy trình nhuộm mẫu: QuantiBRITE PE beads
Lấy 01ống QuantiBRITE PE, cho 0.5 mL dung dịch đệm (PBS với azide bổ sung 0.5% BSA) vào ống → trộn đều
2 Chạy mẫu
- Chạy mẫu trên hệ thống máy Facs canto, vận hành theo quy trình QTXN.HH.201.V1.0đã được Bệnh viện Nhi Trung Ương thơng qua. - Sử dụng phần mềm Facs Diva Software
Sepsis PMN CD64 (ống số 1) Mono HLADR (ống số 2) Quantibrite (ống số 3) Đếm mẫu, thu thập 30000 event/ ống
3 Phân tích kết quả *Ống mẫu PMN CD64
- Ghi nhận cường độ huỳnh quang trung bình (MFI) của CD64 trên tế bào BC đa nhân trung tính (nCD64), tế bào lympho (LyCD64) và mono (mCD64).
- Tính giá trị ABC cho nCD64, LyCD64 và mCD64 * Ống Mono HLA DR
* Phân tích (QuantiBRITE PE beads)
- Ghi nhận cường độ huỳnh quang trung bình (MFI) của HLA-DR trên tế bào monocytes (mHLA-DR) và BC đa nhân trung tính (nHLA-DR). -Tính tốn giá trị ABC cho nHLA-DR và mHLA-DR
- Ghi nhận cường độ huỳnh quang trung bình (MFI) được thể hiện trên hạt QuantiBRITE PE.
- Tính tốn giá trị ABC cho nHLA-DR và mHLA-DR
- Nhập giá trị của nCD64 và mHLA-DR vào phần mềm đã có để tính chỉ số nhiễm khuẩn huyết SI.
2.2.2.6. Xét nghiệm vi sinh
Kỹ thuật cấy máu
Mẫu sử dụng: Máu toàn phần
Thời điểm lấy máu: Khi bệnh nhi được khám lâm sàng và chẩn đoán nhiễm khuẩn sơ sinh, chưa điều trị kháng sinh, hoặc trước khi đổi kháng sinh, khi khơng truyền dịch. Tốt nhất lấy khi trẻ có biểu hiện sốt.
Số lần lấy máu: 1 lần hoặc 2, 3 lần nếu cần. Mỗi lần cách nhau không quá 60 phút.
Mỗi lần lấy 02 chai, tùy thuộc triệu chứng lâm sàng bác sỹ cho chỉ định cấy: 01 chai hiếu khí và 01 chai nấm, hoặc 01 chai hiếu khí và 01 chai kỵ khí.
Các lần lấy máu ở vị trí khác nhau trên cơ thể.
Lấy máu ở tĩnh mạch ngoại vi, thể tích mẫu máu: 1ml
Khi nghi ngờ NKH liên quan đường truyền tĩnh mạch trung tâm, lấy 02 mẫu máu (01 mẫu qua catheter, 01 mẫu tĩnh mạch ngoại vi).
- Bệnh phẩm: Lấy máu đưa vào chai chứa môi trường chuyên dụng và chuyển đến phịng xét nghiệm vi sinh.
- Quy trình cấy máu
Đưa chai chứa bệnh phẩm vào hệ thống máy cấy tự động.
Kết quả của quá trình này nếu có vi khuẩn mọc trong vịng 5 ngày thì
máy sẽ tự động báo và sẽ lấy vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường thạch máu hoặc CHO, đưa vào tủ ấm 370C theo dõi trong 24 giờ.
Chuyển vào máy định danh vi khuẩn và làm kháng sinh đồ tự động.
Máy sẽ cho định danh vi khuẩn và kháng sinh đồ phù hợp vi sinh vật.
Nếu kết quả ở máy cấy tự động chưa mọc vi khuẩn thì tiếp tục duy trì
ni cấy đến 5 ngày mà vẫn âm tính thì sẽ trả lời âm tính.
- Giám sát: Các bước thực hiện được tiến hành theo qui trình và có sự giám sát của Trưởng khoa Vi Sinh, Bệnh viện Nhi Trung ương.
- Tiêu chuẩn phòng xét nghiệm: đạt tiêu chuẩn ISO 15189 năm 2020.
Kỹ thuật lấy dịch não tủy: Bệnh nhi được làm thủ thuật chọc dò tủy sống
tại vị trị L4 - L5. Lấy dịch não tủy qua kim vơ trùng chọc dị tủy sống, cho dịch vào ống nuôi cấy vô trùng.
Kỹ thuật lấy dịch phế quản: Bệnh nhi được đặt nội khí quản. Lấy dịch
phế quản qua sonde vô trùng đặt qua ống nội khí quản, cho dịch vào ống ni cấy vơ trùng.
Kỹ thuật lấynước tiểu nuôi cấy: Trẻ được đặt sonde bàng quang. Sát