Số lượng chu kỳ gồm ba giai đoạn trên được nhắc lại 25-40 lần. Sau mỗi chu kỳ sẽ làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Như vậy sau n chu kỳ,trên lý thuyết, từ một DNA đích đã nhân bản được 2n bản sao. Tuy nhiên, thưởng phản ứng PCR khơng thể đạt hiệu suất 100% vì nhiều lí do. Sản phẩm của phản ứng sau đó sẽ được làm lạnh về nhiệt độ phịng hoặc 4oC, tùy theo mục đích ứng dụng và loại thiết bị tạo chu kì nhiệt được sử dụng [24].
1.3.2. Kỹ thuật RFLP-PCR
Kỹ thuật RFLP-PCR là phương pháp nghiên cứu đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt của các enzyme giới hạn (Restriction Enzyme, RE). Nói cách khác, đây là phương pháp so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắt bằng mẫu bằng một enzyme giới hạn nhằm tìm hiểu xem có hay khơng đột biến điểm (mất hay xuất hiện một vị trí giới hạn mới) hoặc có hay khơng sự thay đổi một trình tự DNA. Nếu trình tự DNA của hai cá thể cùng loài hồn tồn giống nhau về số lượng và kích thước thì sẽ có sự giống nhau về các băng DNA sau khi chạy điện di. Ngược lại nếu có sự xuất hiện đột biến điểm hoặc thay đổi một trình tự đoạn DNA trên sợi DNA thì sẽ có sự khác nhau về các băng DNA. Q trình thực hiện kỹ thuật RFLP-PCR gồm các giai đoạn sau:
- Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi thích hợp để khuếch đại đoạn DNA chứa SNP cần phân tích.
- Tiến hành phân cắt đoạn DNA này với một enzyme giới hạn thích hợp. - Điện di xác định sự khác nhau của các băng DNA và đưa ra kết luận.