1.3.3. Kỹ thuật giải trình tự gen
1.3.3.1. Khái niệm
Giải trình tự gen là tìm ra trình tự sắp xếp của 4 loại nucleotide trên đoạn gen được quan tâm.
1.3.3.2. Các phương pháp giải trình tự gen
Kỹ thuật giải trình tự gen được Sanger cơng bố năm 1977 và là một trong những kỹ thuật đầu tiên được áp dụng phổ biến trong giải trình tự DNA. Có 3 phương pháp giải trình tự cơ bản là phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert, phương pháp enzym của Sanger và phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động.
Phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert
Phương pháp này sử dụng hóa chất liều ít để phá hủy một trong bốn loại nucleotide tạo nên chuỗi DNA.
Trước hết, phân tử DNA được đánh dấu đồng vị phóng xạ 32P ở đầu 5ʹ của mạch đơn, tạo những đoạn đánh dấu có thể phát hiện bằng chụp hình phóng xạ. Sau đó, xử lí hóa học đặc hiệu phân hủy đặc trưng một loại nucleotide của
mạch DNA đã đánh dấu phóng xạ, tạo các đoạn oligonucleotide có chiều dài hơn kém nhau 1 nucleotide được phát hiện bằng điện di. Kết qủa các phản ứng hóa học xử lí mạch DNA được phát hiện bằng điện di trên gel polyacrilamid có thể xác định được trình tự mạch đơn.
Phương pháp enzym của Sanger
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hoạt động của enzym DNA polymerase để tổng hợp mạch bổ sung của trình tự cần xác định. Ngồi các dNTP thông thường, phản ứng cịn có sự tham gia của các dideoxynucletide (ddNTP) đã đánh dấu phóng xạ 32P, ddNTP có cấu trúc giống như dNTP nhưng bị mất nguyên tử oxy ở C số 3 khiến dNTP tiếp theo khơng thể gắn vào làm q trình tổng hợp bị dừng lại. Kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau, được nhận biết nhờ phương pháp điện di và chụp hình phóng xạ.
Hình 1.9. Ngun lý giải trình tự gen bằng phương pháp enzym
(Nguồn: http://classroom.sdmesa.edu)
Giải trình tự gen bằng máy tự động
máy giải trình tự tự động. Máy giải trình tự hoạt động dựa theo nguyên lý của phương pháp Sanger có cải biến. Trong đó các ddNTP khơng được đánh dấu phóng xạ mà được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau cho mỗi loại ddNTP. Máy giải trình tự tự động bao gồm các thành phần chính như: hệ mao quản, hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và xử lý tín hiệu. Các vạch điện di trong mao quản sẽ được phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Hệ thống nhận diện tín hiệu màu sẽ ghi lại và mã hóa thành các nucleotide A, T, G, C.
Các bước giải trình tự trên máy tự động:
Bước 1: PCR đoạn gen cần giải trình tự và tinh sạch sản phẩm PCR. Bước 2: Thực hiện phản ứng chu trình giải trình tự trên máy tự động với một trong hai mồi xuôi (F) hoặc mồi ngược (R) và các thành phần cần thiết khác (dNTP, ddNTP gắn huỳnh quang,…).
Bước 3: Tủa sản phẩm giải trình tự và loại bỏ chất đánh dấu thừa. Bước 4: Điện di mao quản sản phẩm trên máy và đọc kết quả.
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
Nhóm bệnh: 150 bệnh nhân
Tiêu chuẩn lựa chọn:
- Bệnh nhân được chẩn đốn xác định là UTV bằng lâm sàng và mơ bệnh học tại Bệnh viện K cơ sở Tân Triều.
Tiêu chuẩn loại trừ:
- Bệnh nhân mắc ung thư khác phối hợp.
- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu.
Nhóm chứng: 150 người
Tiêu chuẩn lựa chọn:
- Những người khỏe mạnh thông qua các đợt khám sức khỏe định kỳ, không mắc bệnh về vú, tiền sử không mắc ung thư các loại.
- Độ tuổi tương ứng với nhóm bệnh. Tiêu chuẩn loại trừ:
Những đối tượng từ chối tham gia nghiên cứu.
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm nghiên cứu Gen và Protein - Trường Đại học Y Hà Nội, bệnh viện K cơ sở Tân Triều.
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 08/2018 đến tháng 06/2019.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mơ tả cắt ngang có đối chứng. Cỡ mẫu: được tính theo cơng thức
n = Z (1−α/2) 2 p.(1- p) d2
Trong đó:
n: Cỡ mẫu tối thiểu
Z: Sai lầm loại 1 ở mức 1-α/2 (Z=1,96)
p: Tỷ lệ alen G ở nhóm bệnh theo nghiên cứu của Ali Am và cộng sự năm 2016 (p = 0,402) [23]
d: Độ chính xác mong muốn (d = 0,1)
Theo tính tốn, cỡ mẫu nghiên cứu tối thiểu n= 92. Chúng tôi đã tiến hành lấy cỡ mẫu n = 150 bệnh nhân
Quy trình nghiên cứu:
Chọn nhóm bệnh Chọn nhóm chứng Lấy máu Tách chiết DNA PCR đoạn gen XRCC3 Sử dụng enzyme cắt Giải trình tự gen một số mẫu kiểm tra kiểu gen
KẾT QUẢ
Xác định tỉ lệ các kiểu
2.4. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất sử dụng
2.4.1. Dụng cụ
- Pipet các loại và đầu côn các loại 2,5µl, 100µl, 1000µl. - Dụng cụ thủy tinh: cốc thủy tinh, ống đong.
- Ống Eppendorf các cỡ 1,5ml, 0,5ml, 0,2ml. - Găng tay, giấy thấm.
2.4.2. Trang thiết bị
- Tủ an toàn sinh học (Esco Ascent Max). - Tủ lạnh thường (Sanyo).
- Tủ lạnh sâu: -30oC, -80oC (Arctiko). - Tủ ấm (Sanyo OMT Oven).
- Máy ly tâm lạnh, máy ly tâm để bàn (Eppendorf). - Máy vortex (Eppendorf MixMate).
- Máy spindown (Waltex E Centrifuge/ Hanil Science Industrial Micro 6). - Máy đo nồng độ acid nucleic (NanoDrop 2000c).
- Máy ủ (Eppendorf Thermomixer 5437). - Máy điện di (OWL Easycast B2).
- Cân điện tử (AB204). - Lò vi sóng (Saiko).
- Máy soi gel và chụp ảnh tự động (UVP Bio Chemi HP Darkroom).
2.4.3. Hóa chất
2.4.3.1. Hóa chất tách chiết DNA theo KIT Promega
- Dung dịch Cell Lysis Solution - Dung dịch Nuclei Lysis Solution - Dung dịch RNase Solution
- Dung dịch Protein Precipitation Solution - Dung dịch Isopropanol
- Dung dịch ethanol 70%
- Dung dịch hòa tan DNA Rehydration Solution để bảo quản
2.4.3.2. Hóa chất dùng cho điện di
- Dung dịch đêm TBE 1X (Tris Borate EDTA, gồm: Tris base, boric acid và EDTA, pH 8,0).
- Agarose Norgen Biotec corp.
- Marker 100bp (Thermo Scientific GeneRuler 100bp DNA ladder). - DNA loading dye.
- Dung dịch Ethidium Bromide Beckman USA (10 mg/ml).
2.4.3.3. Hóa chất cho PCR
- Nước cất 2 lần đã khử ion.
- GoTaq Green MasterMix Promega gồm: + Dung dịch đệm 2X.
+ dNTPs (dATP, dCTP, dTTP, dGTP), nồng độ 2 mM/mỗi loại. + Enzym Taq DNA polymerase.
+ Loading dye.
- Cặp mồi F (Forward) và R (reverse).
Bảng 2.1. Đặc điểm mồi cho phản ứng PCR
Kích thước đoạn khuếch đại Mồi Trình tự 650bp F 5'-GACACCTCTACAGAGGACG-3 ' R 3'-TTCTCGATGGTTAGGCACAG-5 ' 2.4.3.4. Hóa chất cho phản ứng PCR-RFLP
- Enzym cắt giới hạn PvuII có trình tự nhận biết:
5 '--- CAG CTG --- 3' 3 '--- GTC GAC --- 5'
- NE Buffer .
- Nước cất đã khử ion.
2.4.3.5. Hóa chất cho phản ứng giải trình tự
- Buffer Big dye 5X (ABI/ Mỹ). - Big dye Terminator v3.1 (ABI/ Mỹ). - EDTA.
- Hi-Di formamide (ABI/ Mỹ).
2.5. Quy trình kỹ thuật
2.5.1. Quy trình lấy mẫu
- Tiến hành lấy 2ml máu tĩnh mạch của từng người tham gia nghiên cứu, chống đông bằng EDTA.
- Yêu cầu:
+ Quy trình đảm bảo tuyệt đối vơ trùng.
+ Máu không được đông, không được vỡ hồng cầu. + Mẫu máu cần được tách chiết trong 24-72h.
+ Mẫu DNA tách chiết cần được bảo quản trong tủ lạnh âm sâu (- 20oC) cho đến khi phân tích mẫu.
2.5.2. Quy trình tách chiết DNA và kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch
2.5.2.1.Quy trình tách chiết DNA
DNA được tách chiết theo phương pháp PCI:
- Cho 300 µl máu tươi tồn phần đã chống đơng vào ống Eppendorf 1,5 ml sau đó cho thêm vào 900 µl Cell Lysis Solution rồi lắc 5-6 lần.
- Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm 14000 vòng/phút trong 1 phút ở 22ºC. - Loại bỏ dịch nổi.
- Lặp lại q trình này đến khi thấy tủa trắng (khơng thêm 300 µl máu tươi tồn phần).
Bước 2: Phá vỡ bạch cầu.
- Thêm 300 µl dung dịch Nuclei Lysis Solution và mix bằng pipet. - Vortex 10 – 15 giây.
- Ủ ở 37ºC trong 1 giờ. Nếu sau 1 giờ chưa tan hết cho thêm 100 µl Nuclei Lysis Solution rồi ủ tiếp ở 37ºC trong 1 giờ.
- Thêm 1,5 µl Rnase Solution ủ ở 37ºC trong 15 phút.
- Thêm 100 µl Protein Precipitation Solution. Nếu đã thêm 100 µl Nuclei Lysis Solution ở trên, cho 130 µl Protein Precipitation Solution.
- Vortex 10 – 20 giây.
- Ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút, 22ºC.
Bước 3: Tủa và hịa tan DNA, loại bỏ hóa chất dư thừa.
- Chuyển dịch nổi sang ống mới chứa 300 µl Isopropanol. - Lắc và quan sát tủa DNA.
- Ly tâm 14000 vòng/phút trong 1 phút. - Loại bỏ dịch nổi.
- Thêm 300 µl Ethanol 70%, lắc 5 – 6 lần. - Ly tâm 14000 vòng/phút trong 1 phút.
- Bỏ dịch nổi, để khô trong 56ºC trong 20 phút. - Thêm 50 µl DNA Dehydration Solution.
- Ủ ở 65ºC ở 1 giờ và để qua đêm ở nhiệt độ phịng.
2.5.2.2. Quy trình kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch DNA
phương pháp đo độ hấp thụ quang. Nguyên lý:
Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của các base purin và pyrimidin, hai đơn phân cấu tạo nên DNA mà giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (OD260nm) của các mẫu cho phép xác định nồng độ acid nucleic trong mẫu.
Protein có phổ hấp thụ ánh sáng tử ngoại cực đại ở bước sóng 280nm do có sự hấp thụ ánh sáng của các acid amin nhân thơm và dị vịng (tryptophan, phenylalanine). Ngồi ra protein cũng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm như các acid nucleic khác do đó làm sai lệch giá trị đúng của acid nucleic. Dựa vào tỷ lệ OD260nm/OD280nm để kiểm tra độ tinh sạch của DNA tách chiết.
Mẫu DNA đạt yêu cầu tốt nhất khi: - Nồng độ DNA >50 ng/µL.
- OD260nm/OD280nm= 1,8 – 2.
- OD260nm/OD230nm> 2 (Với 280nm là bước sóng hấp thụ cực đại của protein; 230nm là bước sóng hấp thụ cực đại của cacbohydrat).
2.5.3. Quy trình khuếch đại gen và điện di kiểm tra sản phẩm
2.5.3.1. Quy trình khuếch đại gen (PCR)
Thành phần phản ứng Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất 2 lần 1.4 2 GoTaq 2X 5 3 Mồi xi (2,5 pmol/µl) 0.3
4 Mồi ngược (2,5 pmol/µl) 0.3
5 DNA 3
Tổng thể tích 10
Chu trình nhiệt
Bước Tiến hành Nhiệt độ Thời gian
1 Biến tính 94oC 5 phút
2 Biến tính 94oC 30 giây
35 chu kỳ
3 Gắn mồi 56oC 30 giây
4 Kéo dài 72oC 30 giây
5 Kéo dài 72oC 5 phút
6 Bảo quản 15oC ∞
Sản phẩm khuếch đại nhờ cặp mồi nói trên có kích thước 650bp chứa SNP rs1799796.
2.5.3.2. Quy trình điện di sản phẩm PCR
Chuẩn bị gel agarose 1,5%:
- Hòa tan 0,375g bột agarose trong 25ml TBE 1X.
- Đun hỗn hợp bằng lị vi sóng đến khi thành dung dịch đồng nhất. - Đổ gel vào khay điện di đã có sẵn lược để tạo giếng.
- Để gel đơng đặc hồn tồn trong 40-60 phút
- Cho bản gel vào bể điện di đã có sẵn dung dịch TBE 1X. Tra mẫu điện di:
- Tra 2µl Marker 100bp vào 1 giếng.
- Tra 3µl sản phẩm PCR lần lượt vào các giếng còn lại. Chạy điện di:
- Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 120V trong vòng 15 phút. Nhuộm bản gel đã điện di:
- Ngâm bản gel điện di vào dung dịch Ethidium Bromide 5 mg/mL trong 5-7 phút.
như cặn bẩn.
Chụp ảnh gel: Bản gel sau khi nhuộm với Ethidium Bromide được soi bằng tia tử ngoại. Quan sát các băng DNA xuất hiện trên bản gel và thực hiện chụp lưu giữ kết quả. Với cặp mồi được thiết kế thì sản phẩm PCR thu được sẽ có kích thước 650bp.
2.5.4. Quy trình sử dụng enzym cắt giới hạn và điện di kiểm tra sản phẩm
2.5.4.1. Quy trình sử dụng enzym cắt giới hạn (RFLP-PCR)
Sản phẩm sau khi khuếch đại gen được cắt bằng enzym PvuII.
Enzym PvuII sẽ nhận biết trình tự đặc hiệu trên gen và cắt mảnh DNA tại vị trí:
5’…CAG▼CTG…3’ 3’…GTC▲GAC…5’
Nếu ở vị trí đó đoạn gen chứa nucleotide A, enzym PvuII sẽ nhận biết và cắt thành 2 đoạn DNA có kích thước 283bp và 367bp. Khi nucleotide A bị thay thế bởi nucleotide G sẽ làm mất trình tự nhận biết của enzym PvuII, do đó enzyme sẽ khơng cắt và đoạn gen vẫn cịn ngun kích thước 650bp.
Thành phần phản ứng Bảng 2.4. Thành phần phản ứng RFLP-PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O 1,7 2 Buffer NE 3.1 1 3 Enzym PvuII 0,3 4 Sản phẩm PCR 7 Tổng thể tích 10 Tiến hành
2.5.4.2. Quy trình điện di sản phẩm
Chuẩn bị gel agarose 1,5%.
Cho 10µl sản phẩm đã ủ enzym cắt vào các giếng trên bản gel. Sau đó, cho 3µl DNA Marker 100 bp vào 1 giếng.
Điện di ở hiệu điện thế 80V trong 60 phút.
Nhuộm bản gel đã điện di trong dung dịch Ethidium Bromide trong 5- 7 phút sau đó rửa bằng nước và soi dưới đèn tử ngoại.
Nhận định kết quả, xem số lượng, kích thước, độ rõ các băng với mỗi mẫu và chụp hình lưu giữ kết quả.
- Với kiểu gen đồng hợp GG: 1 băng, kích thước 650bp.
- Với kiểu gen dị hợp AG: 3 băng, kích thước 283bp, 367bp và 650bp. - Với kiểu gen đồng hợp AA: 2 băng, kích thước 283bp và 367bp.
2.5.5. Quy trình giải trình tự gen một số mẫu kiểm tra
Thành phần phản ứng
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng giải trình tự gen
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Nước cất 2 lần 6,5
2 Buffer Big dye 5X 1,5
3 Big dye Terminator v3.1 1
4 Mồi F hoặc R (10 pmol/µl) 0,5
5 DNA 0,5
Chu trình nhiệt
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt phản ứng giải trình tự
Bước Tiến hành Nhiệt độ Thời gian
1 Biến tính 96oC 2 phút 2 Biến tính 96oC 10 giây 25 chu kỳ 3 Gắn mồi 50oC 5 giây 4 Kéo dài 60oC 4 phút 5 Bảo quản 15oC ∞ Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự
- Thêm 60µL cồn 100% + 5µL EDTA vào mẫu cần tinh sạch. - Lắc mạnh, để trong phòng tối 15 phút, nhiệt độ phòng. - Lấy ra ly tâm 15.000 vòng/phút trong 20 phút.
- Loại bỏ dịch nổi.
- Thêm 200µL cồn 70%, ly tâm 15.000 vịng/phút trong 10 phút. - Loại bỏ dịch nổi, để khơ.
- Thêm 20µL Hi-di, ủ ở 95°C trong 5 phút. - Cho vào tủ lạnh khoảng 5 phút.
- Cho vào máy giải trình tự.
Giải trình tự và so sánh kết quả với Gene Bank
Sản phẩm PCR giải trình tự sau khi tinh sạch được giải trình tự trực tiếp bằng máy ABI-3100 và được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench.
Kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự chuẩn: NC_000014 của gen XRCC3 trên GenBank.
2.6. Xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm phân tích SPSS 20.0 để phân tích thống kê. Phân loại các biến số lượng và biến phân hạng. Các biến số lượng được kiểm tra phân bố theo phân phối chuẩn bằng kiểm định Kolmologov-Smirnov. So sánh giá