Kiểu gen <15,4 ≥15,4 Tổng p n % n % n % GG 20 22,7 44 20,8 64 21,3 0,17 AG 45 51,2 89 41,9 134 44,7 AA 23 26,1 79 37,3 102 34,0 Tổng 88 100,0 212 100,0 300 100,0 Nhận xét:
Khi so sánh các kiểu gen theo tuổi có kinh lần đầu, kết quả cho thấy khơng có mối liên quan nào giữa SNP rs1799796 và tình trạng kinh nguyệt, p > 0,05.
3.3.4. SNP rs1799796 và tuổi có con lần đầu
Bảng 3.12. Mối liên quan giữa SNP rs1799796 và tuổi có con lần đầu
Kiểu gen n <25,9 % n ≥ 25,9% n Tổng % p GG 10 25,0 54 20,8 64 21,3 0,831 AG 17 42,5 117 45,0 134 44,7 AA 13 32,5 89 34,2 102 34,0 Tổng 40 100,0 260 100,0 300 100,0 Nhận xét:
Khi so sánh các kiểu gen theo tuổi có con lần đầu, kết quả cho thấy khơng có mối liên quan nào giữa SNP rs1799796 và tuổi có con lần đầu, p > 0,05.
3.4 Mối liên quan của SNP rs1799796 và một số đặc điểm của bệnh
3.4.1 SNP rs17976 và giai đoạn phát hiện bệnh
Bảng 3.13 Phân bố giai đoạn phát hiện bệnh ở nhóm bệnh nhân ung thư vú
Giai đoạn phát hiện bệnh n %
Giai đoạn I 31 20,67
Giai đoạn II 77 51,33
Giai đoạn III 26 17,33
Giai đoạn IV 16 10,67
21%
51% 17%
11%
Giai đoạn I Giai đoạn II Giai đoạn III Giai đoạn IV
Biểu đồ 3.4. Phân bố về giai đoạn phát hiện bệnh ở nhóm bệnh nhân ung thư vú
Nhận xét:
Trong số các bệnh nhân mắc bệnh, hay gặp nhất là các bệnh nhân được chẩn đoán ở giai đoạn II với tỷ lệ là 51,33%. Tiếp theo là giai đoạn I với tỷ lệ là 20,67% và giai đoạn III là 17,33%. Ít gặp nhất là các bệnh nhân được chẩn đốn khi đã ở vào giai đoạn cuối với tỷ lệ là 10,67%.
Bảng 3.14. Mối liên quan giữa kiểu gen của SNP rs1799796 và giai đoạn phát hiện bệnh Kiểu gen Giai đoạn I Giai đoạn II Giai đoạn III Giai đoạn IV Tổng p n % n % n % n % n % AA 8 25,8 27 35,1 6 23,1 6 36,5 47 31,3 0,2 5 AG 15 48,4 31 40,3 17 65,4 9 56,3 72 48,0 GG 8 25,8 19 24,7 3 11,5 1 6,2 31 20,7 Tổng 31 100, 0 77 100, 0 26 100, 0 16 100, 0 15 0 100, 0
Nhận xét:
Tỷ lệ các kiểu gen AA, AG, GG giữa 2 nhóm chẩn đốn sớm (giai đoạn I và II) với nhóm chẩn đốn muộn (giai đoạn III và IV) là khơng có sự khác biệt với p > 0,05.
3.4.2 SNP rs1799796 và vị trí khối u ung thư vú
Bảng 3.15. Phân bố vị trí khối u ở nhóm bệnh nhân ung thư vú
Vị trí u n % Trái 59 39,4 Phải 83 55,3 Hai bên 8 5,3 Tổng 150 100 39% 55% 5%
Trái Phải Hai bên
Biểu đồ 3.5. Phân bố về vị trí khối u ở nhóm bệnh nhân ung thư vú
Nhận xét:
Trong nhóm bệnh nhân ung thư vú, tỉ lệ bệnh nhân có khối ung thư vú phải nhiều nhất (chiếm 55,3%), tiếp theo đó là số bệnh nhân có khối u vú trái (39,4%) và số bệnh nhân có khối u vú 2 bên ít nhất, chỉ chiếm 5,3%.
Bảng 3.16 Mối liên quan giữa kiểu gen của SNP rs1799796 và vị trí khối u
Kiểu gen
Trái Phải Hai bên Tổng
p n % n % n % n % AA 18 30,5 29 34,9 0 0,0 47 31,3 0,234 AG 26 44,1 40 48,2 6 75,0 72 48,0 GG 15 25,4 14 16,9 2 25,0 31 20,7 Tổng 59 100,0 83 100,0 8 100,0 150 100, 0 Nhận xét:
Khơng tìm thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các kiểu gen và vị trí khối u vú với p > 0,05.
3.4.3 SNP rs1799796 và tình trạng thụ thể HER2, ER, PR.
Tình trạng thụ thể ER, PR và HER2 được sử dụng để phân nhóm bệnh nhân ung thư vú thành 2 nhóm dương tính (+) (bỏ qua mức độ dương tính) và âm tính (-).
Bảng 3.17: Phân bố về tình trạng thụ thể ER, PR và HER2 ở nhóm bệnh nhân ung thư vú
Tình trạng marker ER PR HER2 n % n % n % Âm tính 51 34,0 70 46,7 60 40 Dương tính 99 66,0 80 53,3 90 60 Tổng 150 100,0 150 100,0 150 100,0 Nhận xét:
- Trong số các bệnh nhân mắc bệnh, hay gặp nhất là các bệnh nhân có tình trạng dương tính với thụ thể ER, PR và HER2 tùy các mức độ với
tỉ lệ lần lượt là 66%; 53,3% và 60%. Các bệnh nhân âm tính với 3 thụ thể trên chiếm tỉ lệ ít hơn.
Bảng 3.18: Mối liên quan giữa các kiểu gen của SNP rs1799796 và tình trạng ER, PR, HER2 ở nhóm bệnh nhân ung thư vú
ER + - p n % n % AA 28 28,3 19 37,3 0,137 AG 46 46,5 26 50,9 GG 25 25,3 6 11,8 Tổng 99 100,0 51 100,0 PR n + % n - % p AA 27 33,8 20 28,6 0,716 AG 36 45,0 36 51,4 GG 17 21,2 14 20,0 Tổng 80 100,0 70 100,0 HER2 + - p n % n % AA 32 35,6 15 25,0 0,118 AG 37 41,1 35 58,3 GG 21 23,3 10 16,7 Tổng 90 100,0 60 100,0 Nhận xét:
Khơng tìm thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các kiểu gen trong hai nhóm âm tính (-) và dương tính (+) với các thụ thể ER, PR và HER2 với p>0,05.
Trong số nhóm 150 bệnh nhân ung thư vú, chúng tơi nhận thấy có 30 bệnh nhân âm tính với cả 3 thụ thể (ER−, PR− và HER2−) và 35 bệnh nhân đồng thời dương tính với cả 3 thụ thể. Tiến hành phân tích dữ liệu chúng tơi được các bảng sau:
Bảng 3.19: Tỷ lệ các alen của SNP rs1799796 trong nhóm 3 thụ thể âm tính và nhóm chứng
OR (95%CI) n % n % A 37 61,7 172 57,3 p=0,53 1,2(0,72-1,87) G 23 38,3 128 42,7 Tổng 60 100 300 100 Nhận xét:
Nhận thấy trong nhóm bệnh nhân 3 thụ thể âm tính thì có tỉ lệ alen A chiếm nhiều hơn (61,7%), tỉ lệ alen G chỉ chiếm 38,3%. Trong nhóm chứng, alen A cũng chiếm tỉ lệ nhiều hơn (57,3%) trong khi alen G chỉ chiếm 42,7%. Mặc dù 2 nhóm có sự chênh lệch về tỉ lệ alen, tuy nhiên sự khác biệt này khơng có giá trị thống kê với p= 0,53.
Bảng 3.20: Tỷ lệ kiểu gen của SNP rs1799796 trong nhóm 3 thụ thể âm tính và nhóm chứng
Kiểu gen Nhóm 3 âm tính Nhóm chứng p
n % n % AA 11 37 55 36,7 0,51 AG 15 50 62 41,3 GG 4 13 33 22 Tổng 30 100 150 100 Nhận xét:
- Trong nhóm 3 thụ thể âm tính: Kiểu gen AG thường gặp nhất với tỉ lệ 50%, tiếp theo đó là kiểu gen AA (chiếm 37%), ít nhất là kiểu gen GG với tỉ lệ 13%.
- Trong nhóm chứng cũng có tỉ lệ kiểu gen AG cao nhất (41,3%), tiếp theo là kiểu gen AA (chiếm 36,7%) và ít nhất là kiểu gen
Khơng có sự khác biệt về tỉ lệ kiểu gen giữa 2 nhóm bệnh nhân có 3 thụ thể cùng âm tính và nhóm chứng với p>0,05.
Bảng 3.21. Mối liên quan giữa các cặp kiểu gen của SNP rs1799796 trong nhóm 3 thụ thể âm tính và nhóm chứng Các cặp kiểu gen Nhóm 3 âm tính Nhóm BN chứng OR (95%CI) p n % n % GG với AA GG 4 26,7 33 22,0 0,61 (0,22-1,89) 0,42 AA 11 73,3 55 36,7 AG với AA AG 15 57,7 62 41,3 1,21(0,58-2,37) 0,66
AA 11 42,3 55 36,7 GG + AG với AA GG + AG 19 63,3 95 63,3 1 (0,51-1,97) 1,0 AA 11 36,7 55 36,7 GG với AG + AA GG 4 13,3 33 22,0 0,55 (0,22-1,6) 0,29 AG + AA 26 86,7 11 7 78,0 AG với GG + AA AG 15 50 62 41,3 1,42 (0,65-3,11) 0,38 GG + AA 15 50 88 58,7 Nhận xét:
- Tỷ lệ các kiểu gen chứa alen G với các kiểu gen trong nhóm gen cần so sánh đều khơng thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p > 0,05.
Chương 4 BÀN LUẬN
4.1. Đặc điểm của nhóm nghiên cứu
4.1.1. Đặc điểm về tuổi trung bình
Nhóm nghiên cứu của chúng tơi, đã lựa chọn 150 bệnh nhân ung thư vú phù hợp với các tiêu chuẩn lựa chọn vào nhóm bệnh, tương đương với đó là 150 người phụ nữ khỏe mạnh có các đặc điểm tương đương vào nhóm chứng. Độ tuổi của các bệnh nhân thuộc nhóm bệnh dao động từ 23 đến 70 tuổi. Cịn ở nhóm chứng, các đối tượng có độ tuổi dao động từ 29 đến 85 tuổi. Độ tuổi trung bình của nhóm bệnh là 49,53±0,83 cịn tuổi trung bình của nhóm chứng là 49,9±11,6. Sự khác biệt về tuổi trung bình của 2 nhóm là khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. Như vậy nhóm bệnh và nhóm chứng có sự tương đồng về tuổi trung bình.
Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn H.Lan tuổi trung bình mắc bệnh của bệnh nhân ung thư vú là 50± 9,2 [9], cũng tương tự như vậy, theo Đặng Tuyết Hạnh, tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân ung thư vú là 49,64 ± 9,5[25], . Còn theo nghiên cứu tại Thượng Hải của tác giả Zhezhou Huang (2014), tuổi trung bình của các bệnh nhân UTV là 49,89 ± 8,13 tuổi[26]. Như vậy, kết quả của chúng tôi là phù hợp so với các kết quả nghiên cứu trước đó về tuổi trung bình của UTV.
4.1.2. Đặc điểm về nhóm tuổi
Theo kết quả nghiên cứu, ở nhóm bệnh, tỷ lệ mắc bệnh nhiều nhất là ở nhóm tuổi từ 40 – 59 tuổi chiếm 63,4%. Đứng thứ hai là nhóm tuổi ≥ 60 tuổi chiếm 22,0% và ít gặp nhất là nhóm bệnh nhân ≤ 39 tuổi chỉ chiếm 14,7%. Tương tự đối với nhóm chứng, chúng tơi lựa chọn nhóm đối tượng có đặc
điểm về nhóm tuổi tương tự để đạt được sự tương đồng nhằm mang lại kết quả chính xác. Ở nhóm chứng, nhóm tuổi chiếm nhiều nhất cũng là nhóm tuổi từ 40 - 59 tuổi với tỷ lệ là 62,6%. Tiếp sau là nhóm ≤ 39 tuổi và nhóm ≥ 60 tuổi với tỷ lệ lần lượt là 19,3% và 18,0%.
Cũng theo nghiên cứu của Nguyễn H.Lan tại Việt Nam thì tỉ lệ mắc bệnh ung thư vú cao nhất cũng ở nhóm 40-59 tuổi [9]. Nghiên cứu này cũng phù hợp với tác giả Đặng Tuyết Hạnh [25] . Ngoài ra, theo nghiên cứu của tác giả Liu LY và cộng sự (2017) đối với phụ nữ Hán ở miền bắc và miền đông Trung Quốc, bệnh nhân trên 45 tuổi chiếm 63,5% trong tổng số trường hợp [27]. Như vậy, kết quả nghiên cứu về nhóm tuổi mắc bệnh UTV của chúng tơi có kết quả tương đồng với kết quả nghiên cứu của các tác giả trên.
4.1.3 Đặc điểm về tình trạng kinh nguyệt
Kết quả nghiên cứu cho thấy ở nhóm ung thư vú, tỉ lệ hay gặp nhất là các bệnh nhân đã mãn kinh chiếm tỉ lệ 57,3%, các bệnh nhân còn kinh chiếm tỷ lệ ít hơn là 42,7%.Khơng gặp các bệnh nhân ung thư vú trẻ chưa có kinh. Nhóm chứng cũng được lựa chọn theo tình trạng kinh nguyệt tương tự ở nhóm bệnh với các tỉ lệ đối tượng mãn kinh và còn kinh lần lượt là 60% và 40,0%. Sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05.
4.2 Tỷ lệ các alen và kiểu gen của SNP rs1799796
4.2.1 Kết quả tách chiết DNA
Các mẫu máu tồn phần của nhóm bệnh và nhóm chứng được tiến hành tách chiết theo KIT Promega. Để đảm bảo chất lượng của mẫu máu, chúng tôi tiến hành bảo quản mẫu ở 2 - 8ºC và tách chiết DNA của các mẫu máu ngay trong 24 - 48 giờ. Mẫu máu được vận chuyển từ nơi lấy mẫu đến trung tâm Gen - Protein theo đúng nguyên tắc về an tồn sinh học.
Các mẫu DNA sau tách chiết có nồng độ dao động từ 30,1 ng/µl đến 156,5 ng/µl. Một số mẫu DNA có nồng độ khá cao (> 300 ng/µl). Lúc này chúng tơi tiến hành pha loãng bằng cách thêm dung dịch hòa tan DNA Dehydration Solution với tỷ lệ thích hợp để nồng độ các mẫu này trở về nồng độ tối ưu cho phản ứng PCR.
Một số mẫu máu chỉ đạt nồng độ 20 ng/µl đến 30 ng/µl. Chúng tơi đã tiến hành tách lại mẫu máu này tuy nhiên kết quả vẫn không thay đổi do lượng bạch cầu trong mẫu máu thấp.
Độ tinh sạch của mẫu DNA được đo lường bằng tỷ lệ mật độ quang khi đo ở các bước sóng 260 nm và 280 nm (kí hiệu là tỷ số A260/A280). Phương pháp này cho kết quả nhanh với độ chính xác cao. Độ tinh sạch của các mẫu đều đạt từ 1,8 – 2,0. Khơng có mẫu nào có độ tinh sạch < 1,8 tức là các mẫu đều không bị lẫn các tạp chất và đủ điều kiện đế tham gia phản ứng PCR.
Các mẫu DNA sau khi được tách chiết và đo nồng độ, độ tinh sạch, sẽ được bảo quản ở nhiệt độ - 20ºC.
4.2.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR
Điện di trên agarose gel là một trong những phương pháp cổ điển, đơn giản với chi phí thấp để có thể đánh giá được chất lượng của mẫu sản phẩm cần phân tích. Kết quả điện di sản phẩm PCR giúp nghiên cứu viên đánh giá được mẫu DNA có phản ứng hay không, nồng độ sản phẩm PCR là nhiều hay ít, tỷ lệ các thành phần tham gia phản ứng đã phù hợp hay chưa và độ tinh sạch của sản phẩm PCR.
Sau khi tiến hành chạy chuẩn quy trình, chúng tơi lựa chọn ra các sản phẩm PCR có nồng độ tốt để làm chứng dương cho các phản ứng PCR sau đó. Để tạo ra chứng âm, song song với việc mix các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân, chúng tôi mix 1 mẫu chứng âm với tỉ lệ trộn tương tự, thay thế 1,5 µl
DNA bởi 1,5 µl H2O. Tất cả các mẫu bệnh phẩm và chứng âm đều được đưa vào máy PCR để chạy chu trình nhiệt.
Kết quả thu được là các bản gel agarose 1,5% khi soi dưới tia UV đều có vạch marker 100bp, chứng dương hiển thị sắc nét rõ ràng. Chứng âm không xuất hiện băng điện di. Các băng điện di ở các mẫu bệnh phẩm đều xuất hiện với nồng độ tốt, không xuất hiện vạch phụ, kích thước phù hợp ở vị trí 650 bp. Như vậy, quy trình mix PCR của chúng tôi không bị nhiễm chéo. Các mẫu phản ứng tốt. Do sự tuân thủ về các nguyên tắc và kỹ thuật thao tác của quá trình PCR.
4.2.3 Kết quả về kiểu alen và kiểu gen của SNP rs1799796
4.2.3.1 Kết quả điện di sản phẩm cắt đoạn gen XRCC3 bằng enzym PvuII
Đối với các sản phẩm cắt đoạn gen XRCC3 bằng enzym PvuII, chúng tơi sử dụng bản gel agarose có nồng độ 1,5%. Marker cho sản phẩm cắt là marker 100 bp. Chứng AA được lựa chọn là mẫu sản phẩm của bệnh nhân sau khi chuẩn quy trình, ra kết quả kiểu gen là AA và đã được kiểm tra lại bằng giải trình tự. Tương tự đối với chứng GG cũng như vậy. Trên hình ảnh minh họa, chứng AA hiển thị 2 băng điện di ở vị trí 283 bp và 367 bp. Còn chứng GG chỉ hiển thị 1 băng điện di ở vị trí 650 bp.
Các mẫu sản phẩm của bệnh nhân đều cho kết quả tốt với các băng điện di rõ nét, sắc gọn, không nhiễm tạp chất. Độ đậm nhạt của các vạch đều phù hợp. Như vậy enzym cắt đã phản ứng hết với sản phẩm PCR.
Phương pháp PCR-RFLP là một phương pháp kinh tế và đặc hiệu để xác định SNP. Enzym của chúng tôi lựa chọn là enzym PvuII. Đây là 1 enzym cắt tương đối dễ tham gia phản ứng với điều kiện phản ứng đơn giản, cho kết quả chính xác.
Để kiểm tra lại kết quả phản ứng của phương pháp PCR-RFLP, chúng tôi tiến hành giải trình tự các mẫu phản ứng đại diện cho các kiểu gen AA, AG, GG.
Dựa vào hình ảnh giải trình tự có thể thấy chất lượng mẫu cũng như q trình giải trình tự là tốt. Các tín hiệu đều rõ ràng. Ít các tín hiệu nhiễu.
Hình ảnh giải trình tự cũng cho thấy kết quả phân tích mẫu bằng PCR- RFLP và bằng giải trình tự là hồn tồn trùng khớp. Các mẫu có độ dài đoạn gen, vị trí SNP cũng như kiểu gen phù hợp.
4.2.3.3 Tỷ lệ kiểu alen và kiểu gen của SNP rs1799796 trong nhóm nghiên cứu
Về tỷ lệ các kiểu alen :
Sau khi phân tích số liệu, tỉ lệ các loại alen của 2 nhóm bệnh nhân như