Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
Nhóm bệnh: 150 bệnh nhân
Tiêu chuẩn lựa chọn:
- Bệnh nhân được chẩn đốn xác định là UTV bằng lâm sàng và mơ bệnh học tại Bệnh viện K cơ sở Tân Triều.
Tiêu chuẩn loại trừ:
- Bệnh nhân mắc ung thư khác phối hợp.
- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu.
Nhóm chứng: 150 người
Tiêu chuẩn lựa chọn:
- Những người khỏe mạnh thông qua các đợt khám sức khỏe định kỳ, không mắc bệnh về vú, tiền sử không mắc ung thư các loại.
- Độ tuổi tương ứng với nhóm bệnh. Tiêu chuẩn loại trừ:
Những đối tượng từ chối tham gia nghiên cứu.
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm nghiên cứu Gen và Protein - Trường Đại học Y Hà Nội, bệnh viện K cơ sở Tân Triều.
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 08/2018 đến tháng 06/2019.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang có đối chứng. Cỡ mẫu: được tính theo cơng thức
n = Z (1−α/2) 2 p.(1- p) d2
Trong đó:
n: Cỡ mẫu tối thiểu
Z: Sai lầm loại 1 ở mức 1-α/2 (Z=1,96)
p: Tỷ lệ alen G ở nhóm bệnh theo nghiên cứu của Ali Am và cộng sự năm 2016 (p = 0,402) [23]
d: Độ chính xác mong muốn (d = 0,1)
Theo tính tốn, cỡ mẫu nghiên cứu tối thiểu n= 92. Chúng tôi đã tiến hành lấy cỡ mẫu n = 150 bệnh nhân
Quy trình nghiên cứu:
Chọn nhóm bệnh Chọn nhóm chứng Lấy máu Tách chiết DNA PCR đoạn gen XRCC3 Sử dụng enzyme cắt Giải trình tự gen một số mẫu kiểm tra kiểu gen
KẾT QUẢ
Xác định tỉ lệ các kiểu
2.4. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất sử dụng
2.4.1. Dụng cụ
- Pipet các loại và đầu cơn các loại 2,5µl, 100µl, 1000µl. - Dụng cụ thủy tinh: cốc thủy tinh, ống đong.
- Ống Eppendorf các cỡ 1,5ml, 0,5ml, 0,2ml. - Găng tay, giấy thấm.
2.4.2. Trang thiết bị
- Tủ an toàn sinh học (Esco Ascent Max). - Tủ lạnh thường (Sanyo).
- Tủ lạnh sâu: -30oC, -80oC (Arctiko). - Tủ ấm (Sanyo OMT Oven).
- Máy ly tâm lạnh, máy ly tâm để bàn (Eppendorf). - Máy vortex (Eppendorf MixMate).
- Máy spindown (Waltex E Centrifuge/ Hanil Science Industrial Micro 6). - Máy đo nồng độ acid nucleic (NanoDrop 2000c).
- Máy ủ (Eppendorf Thermomixer 5437). - Máy điện di (OWL Easycast B2).
- Cân điện tử (AB204). - Lị vi sóng (Saiko).
- Máy soi gel và chụp ảnh tự động (UVP Bio Chemi HP Darkroom).
2.4.3. Hóa chất
2.4.3.1. Hóa chất tách chiết DNA theo KIT Promega
- Dung dịch Cell Lysis Solution - Dung dịch Nuclei Lysis Solution - Dung dịch RNase Solution
- Dung dịch Protein Precipitation Solution - Dung dịch Isopropanol
- Dung dịch ethanol 70%
- Dung dịch hòa tan DNA Rehydration Solution để bảo quản
2.4.3.2. Hóa chất dùng cho điện di
- Dung dịch đêm TBE 1X (Tris Borate EDTA, gồm: Tris base, boric acid và EDTA, pH 8,0).
- Agarose Norgen Biotec corp.
- Marker 100bp (Thermo Scientific GeneRuler 100bp DNA ladder). - DNA loading dye.
- Dung dịch Ethidium Bromide Beckman USA (10 mg/ml).
2.4.3.3. Hóa chất cho PCR
- Nước cất 2 lần đã khử ion.
- GoTaq Green MasterMix Promega gồm: + Dung dịch đệm 2X.
+ dNTPs (dATP, dCTP, dTTP, dGTP), nồng độ 2 mM/mỗi loại. + Enzym Taq DNA polymerase.
+ Loading dye.
- Cặp mồi F (Forward) và R (reverse).