Kích thước đoạn khuếch đại Mồi Trình tự 650bp F 5'-GACACCTCTACAGAGGACG-3 ' R 3'-TTCTCGATGGTTAGGCACAG-5 ' 2.4.3.4. Hóa chất cho phản ứng PCR-RFLP
- Enzym cắt giới hạn PvuII có trình tự nhận biết:
5 '--- CAG CTG --- 3' 3 '--- GTC GAC --- 5'
- NE Buffer .
- Nước cất đã khử ion.
2.4.3.5. Hóa chất cho phản ứng giải trình tự
- Buffer Big dye 5X (ABI/ Mỹ). - Big dye Terminator v3.1 (ABI/ Mỹ). - EDTA.
- Hi-Di formamide (ABI/ Mỹ).
2.5. Quy trình kỹ thuật
2.5.1. Quy trình lấy mẫu
- Tiến hành lấy 2ml máu tĩnh mạch của từng người tham gia nghiên cứu, chống đơng bằng EDTA.
- u cầu:
+ Quy trình đảm bảo tuyệt đối vơ trùng.
+ Máu không được đông, không được vỡ hồng cầu. + Mẫu máu cần được tách chiết trong 24-72h.
+ Mẫu DNA tách chiết cần được bảo quản trong tủ lạnh âm sâu (- 20oC) cho đến khi phân tích mẫu.
2.5.2. Quy trình tách chiết DNA và kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch
2.5.2.1.Quy trình tách chiết DNA
DNA được tách chiết theo phương pháp PCI:
- Cho 300 µl máu tươi tồn phần đã chống đơng vào ống Eppendorf 1,5 ml sau đó cho thêm vào 900 µl Cell Lysis Solution rồi lắc 5-6 lần.
- Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm 14000 vòng/phút trong 1 phút ở 22ºC. - Loại bỏ dịch nổi.
- Lặp lại q trình này đến khi thấy tủa trắng (khơng thêm 300 µl máu tươi tồn phần).
Bước 2: Phá vỡ bạch cầu.
- Thêm 300 µl dung dịch Nuclei Lysis Solution và mix bằng pipet. - Vortex 10 – 15 giây.
- Ủ ở 37ºC trong 1 giờ. Nếu sau 1 giờ chưa tan hết cho thêm 100 µl Nuclei Lysis Solution rồi ủ tiếp ở 37ºC trong 1 giờ.
- Thêm 1,5 µl Rnase Solution ủ ở 37ºC trong 15 phút.
- Thêm 100 µl Protein Precipitation Solution. Nếu đã thêm 100 µl Nuclei Lysis Solution ở trên, cho 130 µl Protein Precipitation Solution.
- Vortex 10 – 20 giây.
- Ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút, 22ºC.
Bước 3: Tủa và hịa tan DNA, loại bỏ hóa chất dư thừa.
- Chuyển dịch nổi sang ống mới chứa 300 µl Isopropanol. - Lắc và quan sát tủa DNA.
- Ly tâm 14000 vòng/phút trong 1 phút. - Loại bỏ dịch nổi.
- Thêm 300 µl Ethanol 70%, lắc 5 – 6 lần. - Ly tâm 14000 vòng/phút trong 1 phút.
- Bỏ dịch nổi, để khơ trong 56ºC trong 20 phút. - Thêm 50 µl DNA Dehydration Solution.
- Ủ ở 65ºC ở 1 giờ và để qua đêm ở nhiệt độ phịng.
2.5.2.2. Quy trình kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch DNA
phương pháp đo độ hấp thụ quang. Nguyên lý:
Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của các base purin và pyrimidin, hai đơn phân cấu tạo nên DNA mà giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (OD260nm) của các mẫu cho phép xác định nồng độ acid nucleic trong mẫu.
Protein có phổ hấp thụ ánh sáng tử ngoại cực đại ở bước sóng 280nm do có sự hấp thụ ánh sáng của các acid amin nhân thơm và dị vịng (tryptophan, phenylalanine). Ngồi ra protein cũng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm như các acid nucleic khác do đó làm sai lệch giá trị đúng của acid nucleic. Dựa vào tỷ lệ OD260nm/OD280nm để kiểm tra độ tinh sạch của DNA tách chiết.
Mẫu DNA đạt yêu cầu tốt nhất khi: - Nồng độ DNA >50 ng/µL.
- OD260nm/OD280nm= 1,8 – 2.
- OD260nm/OD230nm> 2 (Với 280nm là bước sóng hấp thụ cực đại của protein; 230nm là bước sóng hấp thụ cực đại của cacbohydrat).
2.5.3. Quy trình khuếch đại gen và điện di kiểm tra sản phẩm
2.5.3.1. Quy trình khuếch đại gen (PCR)
Thành phần phản ứng Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất 2 lần 1.4 2 GoTaq 2X 5 3 Mồi xi (2,5 pmol/µl) 0.3
4 Mồi ngược (2,5 pmol/µl) 0.3
5 DNA 3
Tổng thể tích 10
Chu trình nhiệt
Bước Tiến hành Nhiệt độ Thời gian
1 Biến tính 94oC 5 phút
2 Biến tính 94oC 30 giây
35 chu kỳ
3 Gắn mồi 56oC 30 giây
4 Kéo dài 72oC 30 giây
5 Kéo dài 72oC 5 phút
6 Bảo quản 15oC ∞
Sản phẩm khuếch đại nhờ cặp mồi nói trên có kích thước 650bp chứa SNP rs1799796.
2.5.3.2. Quy trình điện di sản phẩm PCR
Chuẩn bị gel agarose 1,5%:
- Hòa tan 0,375g bột agarose trong 25ml TBE 1X.
- Đun hỗn hợp bằng lị vi sóng đến khi thành dung dịch đồng nhất. - Đổ gel vào khay điện di đã có sẵn lược để tạo giếng.
- Để gel đơng đặc hồn tồn trong 40-60 phút
- Cho bản gel vào bể điện di đã có sẵn dung dịch TBE 1X. Tra mẫu điện di:
- Tra 2µl Marker 100bp vào 1 giếng.
- Tra 3µl sản phẩm PCR lần lượt vào các giếng còn lại. Chạy điện di:
- Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 120V trong vòng 15 phút. Nhuộm bản gel đã điện di:
- Ngâm bản gel điện di vào dung dịch Ethidium Bromide 5 mg/mL trong 5-7 phút.
như cặn bẩn.
Chụp ảnh gel: Bản gel sau khi nhuộm với Ethidium Bromide được soi bằng tia tử ngoại. Quan sát các băng DNA xuất hiện trên bản gel và thực hiện chụp lưu giữ kết quả. Với cặp mồi được thiết kế thì sản phẩm PCR thu được sẽ có kích thước 650bp.
2.5.4. Quy trình sử dụng enzym cắt giới hạn và điện di kiểm tra sản phẩm
2.5.4.1. Quy trình sử dụng enzym cắt giới hạn (RFLP-PCR)
Sản phẩm sau khi khuếch đại gen được cắt bằng enzym PvuII.
Enzym PvuII sẽ nhận biết trình tự đặc hiệu trên gen và cắt mảnh DNA tại vị trí:
5’…CAG▼CTG…3’ 3’…GTC▲GAC…5’
Nếu ở vị trí đó đoạn gen chứa nucleotide A, enzym PvuII sẽ nhận biết và cắt thành 2 đoạn DNA có kích thước 283bp và 367bp. Khi nucleotide A bị thay thế bởi nucleotide G sẽ làm mất trình tự nhận biết của enzym PvuII, do đó enzyme sẽ khơng cắt và đoạn gen vẫn cịn ngun kích thước 650bp.
Thành phần phản ứng Bảng 2.4. Thành phần phản ứng RFLP-PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O 1,7 2 Buffer NE 3.1 1 3 Enzym PvuII 0,3 4 Sản phẩm PCR 7 Tổng thể tích 10 Tiến hành
2.5.4.2. Quy trình điện di sản phẩm
Chuẩn bị gel agarose 1,5%.
Cho 10µl sản phẩm đã ủ enzym cắt vào các giếng trên bản gel. Sau đó, cho 3µl DNA Marker 100 bp vào 1 giếng.
Điện di ở hiệu điện thế 80V trong 60 phút.
Nhuộm bản gel đã điện di trong dung dịch Ethidium Bromide trong 5- 7 phút sau đó rửa bằng nước và soi dưới đèn tử ngoại.
Nhận định kết quả, xem số lượng, kích thước, độ rõ các băng với mỗi mẫu và chụp hình lưu giữ kết quả.
- Với kiểu gen đồng hợp GG: 1 băng, kích thước 650bp.
- Với kiểu gen dị hợp AG: 3 băng, kích thước 283bp, 367bp và 650bp. - Với kiểu gen đồng hợp AA: 2 băng, kích thước 283bp và 367bp.
2.5.5. Quy trình giải trình tự gen một số mẫu kiểm tra
Thành phần phản ứng
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng giải trình tự gen
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Nước cất 2 lần 6,5
2 Buffer Big dye 5X 1,5
3 Big dye Terminator v3.1 1
4 Mồi F hoặc R (10 pmol/µl) 0,5
5 DNA 0,5
Chu trình nhiệt
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt phản ứng giải trình tự
Bước Tiến hành Nhiệt độ Thời gian
1 Biến tính 96oC 2 phút 2 Biến tính 96oC 10 giây 25 chu kỳ 3 Gắn mồi 50oC 5 giây 4 Kéo dài 60oC 4 phút 5 Bảo quản 15oC ∞ Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự
- Thêm 60µL cồn 100% + 5µL EDTA vào mẫu cần tinh sạch. - Lắc mạnh, để trong phòng tối 15 phút, nhiệt độ phòng. - Lấy ra ly tâm 15.000 vòng/phút trong 20 phút.
- Loại bỏ dịch nổi.
- Thêm 200µL cồn 70%, ly tâm 15.000 vịng/phút trong 10 phút. - Loại bỏ dịch nổi, để khơ.
- Thêm 20µL Hi-di, ủ ở 95°C trong 5 phút. - Cho vào tủ lạnh khoảng 5 phút.
- Cho vào máy giải trình tự.
Giải trình tự và so sánh kết quả với Gene Bank
Sản phẩm PCR giải trình tự sau khi tinh sạch được giải trình tự trực tiếp bằng máy ABI-3100 và được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench.
Kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự chuẩn: NC_000014 của gen XRCC3 trên GenBank.
2.6. Xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm phân tích SPSS 20.0 để phân tích thống kê. Phân loại các biến số lượng và biến phân hạng. Các biến số lượng được kiểm tra phân bố theo phân phối chuẩn bằng kiểm định Kolmologov-Smirnov. So sánh giá trị trung bình của các biến theo phân phối chuẩn bằng kiểm định Student T- test. So sánh giá trị trung bình của các biến khơng theo phân phối chuẩn bằng kiểm định Mann-Whitney U.
Sau khi kiểu gen của từng mẫu đã được xác định, tần số kiểu gen và alen trong nhóm bệnh và nhóm chứng được so sánh bằng cách sử dụng kiểm định Χ2, test Fisher (kiểm định 2 phía). Phân tích mối liên quan của kiểu gen với bệnh ung thư vú bằng hồi quy logistic đa biến để tính tỷ lệ chênh (OR) với khoảng tin cậy 95% (CI). Nếu giá trị p ≤ 0.05 được coi là có ý nghĩa thống kê.
2.7 . Đạo đức nghiên cứu
Đề tài đã được Hội đồng Đạo đức của trường Đại Học Y Hà Nội chấp thuận theo quyết định số 107/HĐĐĐĐHYHN. Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu. Các thông tin cá nhân được bảo mật.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Đặc điểm của nhóm nghiên cứu
3.1.1. Đặc điểm về tuổi trung bình
Bảng 3.8 Đặc điểm về tuổi trung bình của nhóm bệnh và nhóm chứng
Đặc điểm Nhóm bệnh
(n=150)
Nhóm chứng
(n=150) p
Tuổi trung bình 49,53±0,83 49,9±11,6 0,48
Nhận xét: Với cùng 150 đối tượng ở nhóm bệnh và nhóm chứng, tuổi trung bình của cả hai nhóm là như nhau (p > 0,05) với tuổi trung bình của nhóm bệnh 49,53 ± 0,83 và tuổi trung bình của nhóm chứng là 49,9 ± 11,6.
3.1.2 Đặc điểm về nhóm tuổi
Bảng 3.9 Đặc điểm về nhóm tuổi của nhóm bệnh và nhóm chứng
Nhóm tuổi Nhóm bệnh Nhóm chứng p n % n % ≤ 39 22 14,7 29 19,3 0,656 40 – 49 49 32,7 50 33,3 50 – 59 46 30,7 44 29,3 ≥ 60 33 22,0 27 18,0 Tổng 150 100,0 150 100,0
Benh chung 0% 20% 40% 60% 80% 100% 14.7 19.3 32.7 33.3 30.7 29.3 22 18 ≤ 39 40 – 49 50 – 59 ≥ 60
Biểu đồ 3.2 Đặc điểm về nhóm tuổi của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu
Nhận xét:
- Ở nhóm bệnh, tỷ lệ mắc bệnh nhiều nhất là ở nhóm tuổi từ 40 – 49 tuổi chiếm 32,7%. Đứng thứ hai là nhóm tuổi 50 - 59 tuổi chiếm 30,7% và ít gặp nhất là nhóm bệnh nhân ≤ 39 tuổi chỉ chiếm 14,7%.
- Ở nhóm chứng, nhóm tuổi chiếm nhiều nhất cũng là nhóm tuổi từ 40 – 49 tuổi với tỷ lệ là 33,3%. Đứng thứ 2 là nhóm 50- 59 tuổi với tỉ lệ 29,3%, tiếp theo là nhóm ≤ 39 tuổi và nhóm ≥ 60 tuổi với tỷ lệ lần lượt là 19,3% và 18,0%.
3.1.3 Đặc điểm về tuổi sinh con lần đầu
Bảng 3.10 Đặc điểm về tuổi sinh con lần đầu của nhóm bệnh và nhóm chứng Nhóm tuổi Nhóm bệnh Nhóm chứng p n % n % ≤ 19 1 0,67 3 2,0 0,369 20 – 29 121 80,7 115 76,7 ≥30 26 17,3 26 17,3 Chưa có con 2 1,3 6 4,0 Tổng 150 100,0 150 100,0
Nhóm bệnh Nhóm chứng 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 0.67 2 80.7 76.7 17.3 17.3 1.3 4 ≤ 19 20 – 29 ≥30 Chưa có con
Biểu đồ 3.2 Đặc điểm về tuổi sinh con lần đầu của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu
Nhận xét:
- Ở nhóm bệnh nhân ung thư vú, tỉ lệ bệnh nhân có tuổi sinh con lần đầu từ 20-29 tuổi chiếm tỉ lệ cao nhất (80,7%), ít hơn là bệnh nhân có tuổi sinh con lần đầu ≥30 tuổi (17.3%), ít nhất là số bệnh nhân ≤ 19 tuổi (0.67%).
- Ở nhóm chứng, tỉ lệ có tuổi sinh con lần đầu từ 20- 29 tuổi cũng chiếm tỉ lệ cao nhất (76,7%), ít hơn là số người có tuổi sinh con lần đầu ≥30 tuổi (17.3%), ít nhất cũng là người sinh con lần đầu ≤ 19 tuổi (2,0%).
3.1.4 Đặc điểm về tình trạng kinh nguyệt
Bảng 3.4 Đặc điểm về tình trạng kinh nguyệt của nhóm bệnh và nhóm chứng Tình trạng kinh nguyệt Nhóm bệnh Nhóm chứng p n % n % Mãn kinh 86 57,3 90 60,0 0,639 Còn kinh 64 42,7 60 40,0 Tổng 150 100,0 150 100,0
Nhóm bệnh Nhóm chứng 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 57% 60% 43% 40% Mãn kinh Cịn kinh
Biểu đồ 3.3 Đặc điểm về tình trạng kinh nguyệt của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu
Nhận xét:
- Ở nhóm bệnh nhân ung thư vú , số lượng các bệnh nhân mãn kinh chiếm nhiều nhất với tỉ lệ 57,3%. Các bệnh nhân chưa có kinh chiếm 42,7%.
- Ở nhóm chứng, trong các đối tượng được lựa chọn, những đối tượng mãn cũng chiếm tỷ lệ nhiều nhất là 60%. Các đối tượng cịn kinh chiếm 40%.
3.2. Tính tỉ lệ kiểu alen và kiểu gen của SNP rs1799796 trong nhóm nghiên cứu
3.2.1 Kết quả tách chiết DNA
Hình 3.1 Hình ảnh đo nồng độ và độ tinh sạch của mẫu DNA trên phần mềm NanoDrop 2000
Nhận xét:
Hình 3.1 mơ tả hình ảnh minh họa kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của mẫu DNA mang mã số V80. Phần mềm hiển thị đồ thị đo bên trái. Phía bên phải là các kết quả cụ thể như nồng độ của mẫu DNA ở ô Conc và độ tinh sạch ở ô 260/280.
Bảng 3.5. Nồng độ và độ tinh sạch của một số mẫu DNA đã tách chiết của nhóm bệnh và nhóm chứng Mã số mẫu đo Nồng độ (ng/µl) Độ tinh sạch Mã số mẫu đo Nồng độ (ng/µl) Độ tinh sạch V01 53,1 1,92 C01 132,2 1,87 V02 164,1 1,86 C02 156,5 1,98 V03 82,4 1,91 C03 60,5 1,95 V04 90,8 1,83 C04 66,3 1,90 V05 102,3 1,84 C05 45,6 1,80 V06 48,6 1,80 C06 77,6 1,82 V07 76,9 1,92 C07 54,5 1,82 V08 80,5 1,87 C08 56,6 1,81 V09 42,8 1,88 C09 87,9 1,81 V10 146,3 1,87 C10 99,5 1,94 Nhận xét:
- Kết quả đo nồng độ DNA của có 2 nhóm bệnh nhân và nhóm chứng dao động từ 42 ng/µl đến 164 ng/µl.
- Độ tinh sạch của mẫu DNA sau tách chiết của cả 2 nhóm được đo bằng tỉ số A260/A280 đều nằm trong khoảng 1,80 - 2,00.
Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen XRCC3 chứa SNP rs1799796 ở bệnh nhân ung thư vú
M: marker 100 bp; (+): chứng dương; (-): chứng âm. Các sản phẩm PCR của mẫu DNA lấy từ nhóm bệnh với các bệnh nhân có mã số như trên.
Nhận xét:
- Bản gel sau điện di sản phẩm PCR của đoạn gen XRCC3 chứa SNP rs1799796 ở nhóm bệnh nhân ung thư vú khi soi dưới tia UV cho hình ảnh rõ ràng, sắc nét, khơng xuất hiện vạch phụ.
- Băng điện di có kích thước phù hợp với kích thước của đoạn gen đã PCR là 650 bp.
3.2.3 Kết quả về kiểu alen và kiểu gen của SNP rs1799796
3.2.3.1. Kết quả điện di kiểu gen của SNP rs1799796 bằng phương pháp PCR-RFLP
Hình 3.3: Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen XRCC3 bằng enzym