Dựa theo kết quả ghi nhận được bằng phương pháp đếm mật độ tế bào ở hình 3.1, thời gian sinh trưởng tối ưu nhất của vi khuẩn CT1 và R35 là ở 48 giờ và mật độ tế bào đạt được lần lượt là 193 và 350 (x108 CFU/ml), CT10 tại 24 giờ thu được kết quả 316 (x108 CFU/ml) và 48 giờ là 243 (x108 CFU/ml). Dựa trên kết quả nghiên cứu thì trong khoảng 24 – 48 giờ là khoảng thời gian mà các chủng VSV sinh trưởng tối ưu nhất, nhưng để lựa chọn một thời gian sinh trưởng chung cho cả 03 vi khuẩn thì thích hợp nhất sẽ là 48 giờ vì tại đó CT1 và R35 sẽ đạt đỉnh sinh trưởng và CT10 thì cũng thu được kết quả đo mật độ cao ( 108 CFU/ml).
Xác nhận được thời gian sinh trưởng tối ưu cho 03 chủng CT1, CT10 và R35 là 48h.
3.1.2. Lựa chọn chất mang
Chất mang ngoài thực hiện vai trị làm giá thể bám dính, cố định vi sinh vật cịn có vai trị bảo vệ, duy trì mật độ và hoạt tính của vi sinh vật trong thời gian dài. Mặt khác, khi sử dụng trong xử lý môi trường, chất mang phải lựa chọn là vật liệu không độc, không đưa thêm chất hữu cơ vào môi trường.
Để tạo ra chế phẩm vi sinh vật dạng bột, thuận tiện cho sử dụng và vận chuyển thì đề tài đã tiến hành lựa chọn các loại chất mang phù hợp. Chất mang lựa chọn để sử dụng là trấu xay, cám gạo và than bùn là những vật liệu dễ kiếm, được sử dụng phổ biến trong tạo chế phẩm vi sinh. Than bùn, trấu xay và cám gạo đều được sấy ở nhiệt độ 130°C trong vịng 03 giờ đạt độ ẩm 5%. Sau q trình lên men sinh khối từ 3 chủng CT1, CT10
0 50 100 150 200 250 300 350 400 0 24 48 72 96 Mật độ tế bào (x10 8 CFU/m l) Giờ CT1 CT10 R35
THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG. Lưu hành nội bộ
và R35 trong 48 giờ (thời gian sinh trưởng tối ưu) thì phối trộn các chủng với tỉ lệ hỗn hợp lần lượt 1:1:1, 1:1:2, 1:2:1, 2:1:1 (CT1:CT10:R35) và phối trộn những tỉ lệ đó với chất mang theo tỉ lệ 1:1, 1:2 và 1:3 (VSV: Chất mang) sau đó sấy ở nhiệt độ 40°C trong vòng 60 giờ để đạt độ ẩm 8 – 9%. Sau khi sấy thì hỗn hợp các chế phẩm được cho trong túi polyethylene dán kín và bảo quản ở nhiệt độ thường [23].
Kết quả xác định mật độ vi sinh vật trong các chất mang cho thấy mật độ tế bào vi sinh vật trên các chất mang là khác nhau (bảng 3.3).
Bảng 3.3: Mật độ của vi sinh vật trên chất mang Chất Chất
mang
Tỉ lệ VSV : CM
Mật độ tế bào (x109 CFU/g) 0 ngày 23 ngày 30 ngày
Than Bùn 1:1 1,05 0,6 0,6 1:2 4,6 2,2 1,7 1:3 39,4 1,0 0,8 Trấu xay 1:1 2,2 1,4 1,3 1:2 4,2 3,2 1,5 1:3 3,4 3,1 3,4 Cám gạo 1:1 3,6 0,6 0,4 1:2 6,0 6,0 3,8 1:3 2,0 1,0 0,8
Mật độ tế bào ở bảng 3.3 cho thấy các loại chất mang được sử dụng đều phù hợp cho vi sinh vật đạt ở mức từ 108 – 109 CFU/g ở thời điểm ban đầu, kể cả sau 30 ngày thì đều đạt trên mức 108 CFU/g [43] và sẵn sàng để sử dụng sản xuất chế phẩm.
Vì cả 03 chất mang đều đạt các tiêu chuẩn về kỹ thuật để lựa chọn nên ta sẽ dựa trên các tiêu chí khác về giá thành và khả năng bảo quản để tiến hành chọn chất mang phù hợp.
THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG. Lưu hành nội bộ Bảng 3.4: Tiêu chí khác so sánh chất mang
Chất mang
Giá thành tại
thời điểm mua Khả năng bảo quản
Khối lượng sau khi sấy 130°C
trong 3h
Than Bùn
20.000
VNĐ/1kg Bảo quản ở nhiệt độ thường Giảm 40% so với ban đầu
Trấu xay 1.000 VNĐ/1kg Bảo quản ở nhiệt độ
thường Ít thay đổi
Cám gạo 8.000 VNĐ/1kg mốc, mọt gạo và vón Dễ xuất hiện ẩm cục
Giảm 10% so với ban đầu
Dựa vào các tiêu chí phụ ta thấy trấu xay là chất mang có giá thành rẻ nhất. Than bùn và trấu xay đều là chất mang dễ bảo quản nhưng với kết quả khối lượng giảm lớn sau khi tiến hành sấy 130°C thì khối lượng than bùn giảm đến 40% so với khối lượng ban đầu. Cám gạo thì khối lượng chỉ giảm 10% so với ban đầu sau quá trình sấy và giá thành chỉ 8.000 đồng/kg nhưng lại khó bảo quản bởi dễ vón cục và xuất hiện mọt gạo. Dựa trên những tiêu chỉ phụ nêu ở bảng 3.4 thì đề tài lựa chọn trấu xay là chất mang sẽ sử dụng để tiếp tục nghiên cứu.
3.1.3. Nghiên cứu xác định tỉ lệ phối trộn giữa các chủng vi sinh vật và giữa hỗn hợp vi sinh vật với chất mang vi sinh vật với chất mang
3.1.3.1. Tỉ lệ phối trộn giữa các chủng vi sinh vật
Tỉ lệ giữa các chủng vi sinh vật được sắp xếp theo thứ tự CT1:CT10:R35.
Từ kết quả được trình bày trong bảng 3.5 cho thấy, vì chất mang được sử dụng là chất trơ, nên sẽ không tránh khỏi việc suy giảm mật độ tế bào và các tỉ lệ phối trộn dịch sinh khối ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của chúng trên chất mang trấu xay.
Đối với tỉ lệ 1:1:1 ở thời điểm ban đầu và ngày thứ 30 kết quả mật độ thu được là 2,2x109 CFU/g và 1,3x109 CFU/g, ở tỉ lệ 1:2:1 là 5,7x109 CFU/g và 3,2x109 CFU/g và tỉ lệ 2:1:1 là 4,1x109 CFU/g và 2,4x109 CFU/g đều giảm so với ban đầu. Riêng chỉ có tỉ lệ 1:1:2 là tăng mật độ tế bào so với ban đầu nhưng kết quả thu được thấp nhất tại thời điểm ban đầu và thấp nhì tại thời điểm 30 ngày. Các tỉ lệ phối trộn sau 30 ngày đều thu được kết quả tốt ( 108 CFU/g).
Và lựa chọn của đề tài cho tỉ lệ có mật độ tế bào lớn nhất giữa các chủng vi sinh vật nên tỉ lệ 1:2:1 sẽ được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo, bởi kết quả ở tỉ lệ 1:2:1 (CT1:CT10:R35) tại thời điểm ban đầu là 5,7x109 CFU/g và ở ngày thứ 23 là 6x109
THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG. Lưu hành nội bộ
CFU/g và ở ngày thứ 30 là 3,2x109 CFU/g lớn nhất trong các tỉ lệ tiến hành phối trộn.
Bảng 3.5: Tỉ lệ phối trộn giữa các chủng vi sinh vật
Tỉ lệ giữa các chủng vi sinh vật
Mật độ tế bào (x109 CFU/g) 0 ngày 23 ngày 30 ngày
1:1:1 2,2 1,4 1,3
1:1:2 1,0 1,0 1,8
1:2:1 5,7 6,0 3,2
2:1:1 4,1 2,5 2,4
3.1.3.2. Tỉ lệ phối trộn giữa hỗn hợp vi sinh vật với chất mang
Tỉ lệ phối trộn giữa dịch sinh khối với chất mang ảnh hưởng tới mật độ vi sinh sống trong chế phẩm. Nếu tỉ lệ thấp, mật độ vi sinh sẽ không đảm bảo nhưng với tỉ lệ quá cao sẽ kéo dài thời gian sấy và gây lãng phí. Để đảm bảo mật độ vi sinh và tiết kiệm chi phí, đề tài đã tiến hành phối trộn sinh khối hỗn hợp các vi sinh vật với chất mang theo tỉ lệ thay đổi, sau sấy ở 40°C đạt độ ẩm 8% – 9%.
Bảng 3.6: Tỉ lệ phối trộn giữa hỗn hợp vi sinh vật với chất mang
Tỉ lệ VSV : CM
Mật độ tế bào (x109 CFU/g) Thời gian sấy
(giờ) 0 ngày 23 ngày 30 ngày
1:1 2,2 1,4 1,3 84
1:2 9,3 5,9 1,9 60
1:3 2,0 6 4,5 44
Theo kết quả thu được từ bảng 3.6, thì các tỉ lệ phối trộn có ảnh hưởng khác nhau đến khả năng tồn tại của VSV trên nền chất mang trấu xay, và kết quả ở các tỉ lệ phối trộn đều thu được kết quả ≥ 109 CFU/g. Sau 30 ngày bảo quản thì mật độ đã có sự thay đổi lớn, sự suy giảm mật độ ở tỉ lệ 1:1 tại thời điểm ban đầu và sau 30 ngày lần lượt là 2,2x109 CFU/g và 1,3x109 CFU/g, đối với tỉ lệ 1:2 là 9,3x109 CFU/g và 1,9x109 CFU/g và tỉ lệ ở tỉ lệ 1:3 thì có sự tăng mật độ tế bào khi ở thời điểm ban đầu là 2x109 CFU/g và sau 30 ngày là 4,5x109 CFU/g và vì chất mang là chất trơ nên việc gia tăng mật độ tế bào là điều khó xảy ra.
Để đảm bảo tính ổn định, và sau thời gian sấy 40°C thì chế phẩm sẽ được sử dụng trực tiếp cho quá trình ủ phân hữu cơ nên đề tài sẽ lựa chọn tỉ lệ phối trộn giữa hỗn hợp vi sinh vật với chất mang là tỉ lệ 1:2.
THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG. Lưu hành nội bộ
3.1.4. Xác định chất lượng và thời gian bảo quản chế phẩm vi sinh vật
Chế phẩm sau khi tạo thành được bảo quản trong túi polyetylen tráng thiếc, bảo quản ở nhiệt độ thường. Khi tiến hành xác định mật độ vi sinh của chế phẩm sau thời gian bảo quản 15, 30, 45 và 60 ngày trong túi polyetylen, kết quả sau khi xác định mật độ được thể hiện ở bảng 3.7 đều đạt tiêu chuẩn kỹ thuật (≥ 108 CFU/g). Có xuất hiện sự suy giảm mật độ trong thời gian bảo quản, nhưng mật độ tế bào vẫn trên 108 CFU/g. [37].
Bảng 3.7: Mật độ tế bào trong thời gian bảo quản
Chất mang Tỉ lệ giữa các chủng VSV Tỉ lệ VSV : CM Mật độ tế bào (x108 CFU/g)
0 ngày 15 ngày 30 ngày 45 ngày 60 ngày
Trấu
xay 1:2:1 1:2 146,0 89,8 60,6 46,6 36,3