Hoạt tính enzyme (D-d, mm) Chủng vi khuẩn Nhiệt độ (C) 20 30 40 50 60 Amylase CT1 7,74 11,14 12,42 7,33 8,42 CT10 9,29 12,76 12,55 9,26 9,26 R35 6,59 8,16 8,19 7,55 5,83 Cellulase CT1 21,29 12,76 12,42 8,79 8,42 CT10 11,85 9,47 14,34 15,48 14,77 R35 18,59 8,91 18,64 19,44 12,16 Protease CT1 15,76 18,57 25,05 15,05 7,58 CT10 13,98 22,97 27,06 12,02 17,22 R35 8,70 21,23 17,81 11,13 19,99
THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG. Lưu hành nội bộ
- Ảnh hưởng của pH môi trường:
Mỗi chủng vi sinh vật có thể phát triển ở dải các giá trị pH khác nhau, khi thay đổi pH môi trường, tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật cũng bị thay đổi. Tại giá trị pH môi trường tối ưu, vi sinh vật sẽ có tốc độ phát triển lớn nhất.
Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của pH tới sự phát triển sinh khối của 3 chủng
Bacillus trong đề tài khá tương đồng với công bố của một số tác giả khác cho rằng các
chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus có khả năng thích ứng và phát triển sinh khối tốt ở dải pH môi trường khá rộng [39, 41].
Dựa trên kết quả thu được bảng 3.2, cả 03 chủng VSV đều hoạt động tốt trong dải pH 5 – 8. Vì vậy việc áp dụng 03 chủng vào ứng dụng xử lý chất thải là có khả năng vì với khả năng hoạt động tốt trong dải pH rộng thì các chủng VSV này đều có thể tồn tại nếu mơi trường pH trong đống ủ thay đổi. Và theo kết quả nghiên cứu được thì dải pH tốt nhất để 03 chủng VSV thích ứng, phát triển và hoạt động tốt nhất là ở pH 6 – 7. Bảng 3.2: Ảnh hưởng của pH Hoạt tính enzyme (D-d, mm) Chủng vi khuẩn pH 5 6 7 8 Amylase CT1 7,27 10,79 13,36 8,77 CT10 7,87 9,80 7,54 7,50 R35 6,03 9,29 9,53 6,17 Cellulase CT1 11,60 8,57 6,67 13,35 CT10 8,35 6,57 9,83 20,83 R35 6,22 13,46 9,96 10,19 Protease CT1 14,86 9,70 25,98 10,45 CT10 9,03 27,66 24,12 12,57 R35 13,95 25,10 12,93 16,42
THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG. Lưu hành nội bộ
Động thái sinh trưởng:
Hình 3.1: Đồ thị động thái sinh trưởng của các chủng vi sinh vật
Dựa theo kết quả ghi nhận được bằng phương pháp đếm mật độ tế bào ở hình 3.1, thời gian sinh trưởng tối ưu nhất của vi khuẩn CT1 và R35 là ở 48 giờ và mật độ tế bào đạt được lần lượt là 193 và 350 (x108 CFU/ml), CT10 tại 24 giờ thu được kết quả 316 (x108 CFU/ml) và 48 giờ là 243 (x108 CFU/ml). Dựa trên kết quả nghiên cứu thì trong khoảng 24 – 48 giờ là khoảng thời gian mà các chủng VSV sinh trưởng tối ưu nhất, nhưng để lựa chọn một thời gian sinh trưởng chung cho cả 03 vi khuẩn thì thích hợp nhất sẽ là 48 giờ vì tại đó CT1 và R35 sẽ đạt đỉnh sinh trưởng và CT10 thì cũng thu được kết quả đo mật độ cao ( 108 CFU/ml).
Xác nhận được thời gian sinh trưởng tối ưu cho 03 chủng CT1, CT10 và R35 là 48h.
3.1.2. Lựa chọn chất mang
Chất mang ngoài thực hiện vai trị làm giá thể bám dính, cố định vi sinh vật cịn có vai trị bảo vệ, duy trì mật độ và hoạt tính của vi sinh vật trong thời gian dài. Mặt khác, khi sử dụng trong xử lý môi trường, chất mang phải lựa chọn là vật liệu không độc, không đưa thêm chất hữu cơ vào môi trường.
Để tạo ra chế phẩm vi sinh vật dạng bột, thuận tiện cho sử dụng và vận chuyển thì đề tài đã tiến hành lựa chọn các loại chất mang phù hợp. Chất mang lựa chọn để sử dụng là trấu xay, cám gạo và than bùn là những vật liệu dễ kiếm, được sử dụng phổ biến trong tạo chế phẩm vi sinh. Than bùn, trấu xay và cám gạo đều được sấy ở nhiệt độ 130°C trong vịng 03 giờ đạt độ ẩm 5%. Sau q trình lên men sinh khối từ 3 chủng CT1, CT10
0 50 100 150 200 250 300 350 400 0 24 48 72 96 Mật độ tế bào (x10 8 CFU/m l) Giờ CT1 CT10 R35
THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG. Lưu hành nội bộ
và R35 trong 48 giờ (thời gian sinh trưởng tối ưu) thì phối trộn các chủng với tỉ lệ hỗn hợp lần lượt 1:1:1, 1:1:2, 1:2:1, 2:1:1 (CT1:CT10:R35) và phối trộn những tỉ lệ đó với chất mang theo tỉ lệ 1:1, 1:2 và 1:3 (VSV: Chất mang) sau đó sấy ở nhiệt độ 40°C trong vòng 60 giờ để đạt độ ẩm 8 – 9%. Sau khi sấy thì hỗn hợp các chế phẩm được cho trong túi polyethylene dán kín và bảo quản ở nhiệt độ thường [23].
Kết quả xác định mật độ vi sinh vật trong các chất mang cho thấy mật độ tế bào vi sinh vật trên các chất mang là khác nhau (bảng 3.3).
Bảng 3.3: Mật độ của vi sinh vật trên chất mang Chất Chất
mang
Tỉ lệ VSV : CM
Mật độ tế bào (x109 CFU/g) 0 ngày 23 ngày 30 ngày
Than Bùn 1:1 1,05 0,6 0,6 1:2 4,6 2,2 1,7 1:3 39,4 1,0 0,8 Trấu xay 1:1 2,2 1,4 1,3 1:2 4,2 3,2 1,5 1:3 3,4 3,1 3,4 Cám gạo 1:1 3,6 0,6 0,4 1:2 6,0 6,0 3,8 1:3 2,0 1,0 0,8
Mật độ tế bào ở bảng 3.3 cho thấy các loại chất mang được sử dụng đều phù hợp cho vi sinh vật đạt ở mức từ 108 – 109 CFU/g ở thời điểm ban đầu, kể cả sau 30 ngày thì đều đạt trên mức 108 CFU/g [43] và sẵn sàng để sử dụng sản xuất chế phẩm.
Vì cả 03 chất mang đều đạt các tiêu chuẩn về kỹ thuật để lựa chọn nên ta sẽ dựa trên các tiêu chí khác về giá thành và khả năng bảo quản để tiến hành chọn chất mang phù hợp.
THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG. Lưu hành nội bộ Bảng 3.4: Tiêu chí khác so sánh chất mang
Chất mang
Giá thành tại
thời điểm mua Khả năng bảo quản
Khối lượng sau khi sấy 130°C
trong 3h
Than Bùn
20.000
VNĐ/1kg Bảo quản ở nhiệt độ thường Giảm 40% so với ban đầu
Trấu xay 1.000 VNĐ/1kg Bảo quản ở nhiệt độ
thường Ít thay đổi
Cám gạo 8.000 VNĐ/1kg mốc, mọt gạo và vón Dễ xuất hiện ẩm cục
Giảm 10% so với ban đầu
Dựa vào các tiêu chí phụ ta thấy trấu xay là chất mang có giá thành rẻ nhất. Than bùn và trấu xay đều là chất mang dễ bảo quản nhưng với kết quả khối lượng giảm lớn sau khi tiến hành sấy 130°C thì khối lượng than bùn giảm đến 40% so với khối lượng ban đầu. Cám gạo thì khối lượng chỉ giảm 10% so với ban đầu sau quá trình sấy và giá thành chỉ 8.000 đồng/kg nhưng lại khó bảo quản bởi dễ vón cục và xuất hiện mọt gạo. Dựa trên những tiêu chỉ phụ nêu ở bảng 3.4 thì đề tài lựa chọn trấu xay là chất mang sẽ sử dụng để tiếp tục nghiên cứu.
3.1.3. Nghiên cứu xác định tỉ lệ phối trộn giữa các chủng vi sinh vật và giữa hỗn hợp vi sinh vật với chất mang vi sinh vật với chất mang
3.1.3.1. Tỉ lệ phối trộn giữa các chủng vi sinh vật
Tỉ lệ giữa các chủng vi sinh vật được sắp xếp theo thứ tự CT1:CT10:R35.
Từ kết quả được trình bày trong bảng 3.5 cho thấy, vì chất mang được sử dụng là chất trơ, nên sẽ không tránh khỏi việc suy giảm mật độ tế bào và các tỉ lệ phối trộn dịch sinh khối ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của chúng trên chất mang trấu xay.
Đối với tỉ lệ 1:1:1 ở thời điểm ban đầu và ngày thứ 30 kết quả mật độ thu được là 2,2x109 CFU/g và 1,3x109 CFU/g, ở tỉ lệ 1:2:1 là 5,7x109 CFU/g và 3,2x109 CFU/g và tỉ lệ 2:1:1 là 4,1x109 CFU/g và 2,4x109 CFU/g đều giảm so với ban đầu. Riêng chỉ có tỉ lệ 1:1:2 là tăng mật độ tế bào so với ban đầu nhưng kết quả thu được thấp nhất tại thời điểm ban đầu và thấp nhì tại thời điểm 30 ngày. Các tỉ lệ phối trộn sau 30 ngày đều thu được kết quả tốt ( 108 CFU/g).
Và lựa chọn của đề tài cho tỉ lệ có mật độ tế bào lớn nhất giữa các chủng vi sinh vật nên tỉ lệ 1:2:1 sẽ được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo, bởi kết quả ở tỉ lệ 1:2:1 (CT1:CT10:R35) tại thời điểm ban đầu là 5,7x109 CFU/g và ở ngày thứ 23 là 6x109
THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG. Lưu hành nội bộ
CFU/g và ở ngày thứ 30 là 3,2x109 CFU/g lớn nhất trong các tỉ lệ tiến hành phối trộn.
Bảng 3.5: Tỉ lệ phối trộn giữa các chủng vi sinh vật
Tỉ lệ giữa các chủng vi sinh vật
Mật độ tế bào (x109 CFU/g) 0 ngày 23 ngày 30 ngày
1:1:1 2,2 1,4 1,3
1:1:2 1,0 1,0 1,8
1:2:1 5,7 6,0 3,2
2:1:1 4,1 2,5 2,4
3.1.3.2. Tỉ lệ phối trộn giữa hỗn hợp vi sinh vật với chất mang
Tỉ lệ phối trộn giữa dịch sinh khối với chất mang ảnh hưởng tới mật độ vi sinh sống trong chế phẩm. Nếu tỉ lệ thấp, mật độ vi sinh sẽ không đảm bảo nhưng với tỉ lệ quá cao sẽ kéo dài thời gian sấy và gây lãng phí. Để đảm bảo mật độ vi sinh và tiết kiệm chi phí, đề tài đã tiến hành phối trộn sinh khối hỗn hợp các vi sinh vật với chất mang theo tỉ lệ thay đổi, sau sấy ở 40°C đạt độ ẩm 8% – 9%.
Bảng 3.6: Tỉ lệ phối trộn giữa hỗn hợp vi sinh vật với chất mang
Tỉ lệ VSV : CM
Mật độ tế bào (x109 CFU/g) Thời gian sấy
(giờ) 0 ngày 23 ngày 30 ngày
1:1 2,2 1,4 1,3 84
1:2 9,3 5,9 1,9 60
1:3 2,0 6 4,5 44
Theo kết quả thu được từ bảng 3.6, thì các tỉ lệ phối trộn có ảnh hưởng khác nhau đến khả năng tồn tại của VSV trên nền chất mang trấu xay, và kết quả ở các tỉ lệ phối trộn đều thu được kết quả ≥ 109 CFU/g. Sau 30 ngày bảo quản thì mật độ đã có sự thay đổi lớn, sự suy giảm mật độ ở tỉ lệ 1:1 tại thời điểm ban đầu và sau 30 ngày lần lượt là 2,2x109 CFU/g và 1,3x109 CFU/g, đối với tỉ lệ 1:2 là 9,3x109 CFU/g và 1,9x109 CFU/g và tỉ lệ ở tỉ lệ 1:3 thì có sự tăng mật độ tế bào khi ở thời điểm ban đầu là 2x109 CFU/g và sau 30 ngày là 4,5x109 CFU/g và vì chất mang là chất trơ nên việc gia tăng mật độ tế bào là điều khó xảy ra.
Để đảm bảo tính ổn định, và sau thời gian sấy 40°C thì chế phẩm sẽ được sử dụng trực tiếp cho quá trình ủ phân hữu cơ nên đề tài sẽ lựa chọn tỉ lệ phối trộn giữa hỗn hợp vi sinh vật với chất mang là tỉ lệ 1:2.
THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG. Lưu hành nội bộ
3.1.4. Xác định chất lượng và thời gian bảo quản chế phẩm vi sinh vật
Chế phẩm sau khi tạo thành được bảo quản trong túi polyetylen tráng thiếc, bảo quản ở nhiệt độ thường. Khi tiến hành xác định mật độ vi sinh của chế phẩm sau thời gian bảo quản 15, 30, 45 và 60 ngày trong túi polyetylen, kết quả sau khi xác định mật độ được thể hiện ở bảng 3.7 đều đạt tiêu chuẩn kỹ thuật (≥ 108 CFU/g). Có xuất hiện sự suy giảm mật độ trong thời gian bảo quản, nhưng mật độ tế bào vẫn trên 108 CFU/g. [37].
Bảng 3.7: Mật độ tế bào trong thời gian bảo quản
Chất mang Tỉ lệ giữa các chủng VSV Tỉ lệ VSV : CM Mật độ tế bào (x108 CFU/g)
0 ngày 15 ngày 30 ngày 45 ngày 60 ngày
Trấu
xay 1:2:1 1:2 146,0 89,8 60,6 46,6 36,3
Hình 3.2: Chế phẩm được bảo quản trong túi polyetylen
3.1.5. Quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật
Sau các kết quả thu được từ các nghiên cứu ở trên, đề tài xây dựng nên một quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật, các bước thực hiện của quy trình được thể hiện ở hình 3.3.
Từ 03 chủng Bacillus, thơng qua q trình khảo sát động thái sinh trưởng, ảnh hưởng của nhiệt độ và pH của các chủng. Ta xây dựng nên được quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật để ứng dụng xử lý chất thải rắn sinh hoạt hữu cơ thành phân bón hữu cơ.
THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG. Lưu hành nội bộ Hình 3.3: Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật
Các bước tiến hành:
Bước 1: Cấy truyền giống gốc sang môi trường các ống nghiệm thạch nghiêng để thu được ống giống cấp 1, ủ trong tủ ấm 32°C trong 48 giờ. Thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Bước 2: Sấy chất mang ở nhiệt độ 130°C trong 3 giờ. Bảo quản trong tủ cách ẩm trong thời gian chờ hỗn hợp dịch sinh khối vi khuẩn.
Bước 3: Lên men thu sinh khối trong môi trường dịch thể NA, từ ống nghiệm thạch nghiêng ta tiến hành thu và cấy dịch vi khuẩn sang môi trường dịch thể NA ở pH=7, ni trên máy lắc 150 vịng/phút trong 48 giờ ở nhiệt độ thường.
Bước 4: Phối trộn dịch thể NA chứa các chủng vi sinh vật theo tỉ lệ 1:2:1 (CT1:CT10:R35).
THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG. Lưu hành nội bộ
đó sấy ở 40°C trong 60 giờ.
Bước 6: Sau quá trình sấy 60 giờ. Thu được chế phẩm vi sinh vật, bảo quản trong túi polyetylen ở nhiệt độ thường.
3.1.6. So sánh chế phẩm nổi bật trên thị trường.
Chế phẩm mà đề tài nghiên cứu sản xuất được là chế phẩm dạng bột, nên sẽ tiến hành so sánh với các chế phẩm dạng bột EMIC, Emuniv và S.EM.
Tiêu chí so sánh là mật độ tế bào vi sinh vật.
Bảng 3.8: Mật độ tế bào của các chế phẩm dạng bột
Tên chế phẩm dạng bột Kết quả mật độ tế bào (CFU/g) TCVN 7304-1:2003 (CFU/g) So sánh với TCVN 7304- 1:2003 Chế phẩm từ đề tài 36,3x 108 1x108 Đạt Chế phẩm EMIC ≥ 108 1x108 Đạt Chế phẩm Emuniv ≥ 108 1x108 Đạt Chế phẩm S.EM ≥ 108 1x108 Đạt
Dựa trên kết quả từ bảng 3.8, ta thấy chế phẩm vi sinh vật được sản xuất từ đề tài nghiên cứu so sánh với các chế phẩm dạng bột nổi bật trên thị trường thì đều đảm bảo mật độ tế bào ≥ 108 CFU/g và đạt TCVN 7304-1:2003 [43].
3.2. Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu để xử lý chất thải rắn sinh hoạt hữu cơ làm phân bón hữu cơ sinh học
3.2.1. Xây dựng quy trình ủ phân
CTRSH hữu cơ được lựa chọn để tiến hành ủ phân là CTRSH hữu cơ dễ phân huỷ được lấy từ trạm trung chuyển khu vực Thuận Phước (dưới chân cầu Thuận Phước).
THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG. Lưu hành nội bộ Hình 3.4: Quy trình tiến hành ủ phân
Hình 3.5: Lựa chọn chất thải rắn hữu cơ tại Thuận Phước
Vị trí ủ phân: Tại trung tâm cơng nghệ sinh học Đà Nẵng Các bước thực hiện ủ phân sau khi tạo ra chế phẩm: Bước 1: Phối trộn
THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG. Lưu hành nội bộ
Chất thải rắn sinh hoạt hữu cơ dễ phân hủy 20kg được băm nhỏ đạt kích thước từ 3-5cm.
Chia vào thùng xốp có kích thước 38x35x25cm (DxRxC) mỗi thùng chứa 5kg. Sau đó cho 150 g phân lân và 100 g phân vôi vào mỗi thùng, trộn đều. Đối với mẫu I (đối chứng) không bổ sung chế phẩm, đối với mẫu II, mẫu III, mẫu IV tiến hành bổ sung chế phẩm với tỉ lệ lần lượt 2% (100 g), 5% (250 g) và 10% (500 g)
Bước 2: Đảo trộn và kiểm tra độ ẩm
Tiến hành đảo trộn đều khối ủ, sau đó tiến hành kiểm tra độ ẩm bằng phương pháp đo nhanh, đến khi độ ẩm đạt 50 – 60%.
Bước 3: Che phủ khối ủ
Sau khi trộn đều, tiến hành đo các thông số nhiệt độ, chiều cao khối ủ. Sau đó, che đậy thùng bằng nắp thùng, để nơi khơ ráo thống mát, tránh trời mưa.
Bước 4: Ủ và kiểm tra các thông số
Lần lượt kiểm tra độ ẩm và chiều cao, 3 ngày tiến hành kiểm tra nhiệt độ và ghi chép các thông số độ ẩm, nhiệt độ, chiều cao, pH và đánh giá cảm quan của mỗi công