3.1. Phản ứng kết tủa trong môi trường lỏng
Phản ứng kết tủa tạo vịng.
Là phản ứng có tính chất định tính.
Dùng 1 ống nghiệm nhỏ, cho vào đó một lượng kháng nguyên hoà tan (0.5ml).
Cho 0.5ml kháng huyết thanh vào, cho vào từ đáy ống, kháng huyết thanh sẽ đội kháng nguyên lên. Sau thời gian 15 – 20 phút tại vùng tiếp xúc sẽ xuất hiện một đĩa tủa mỏng.
Phản ứng này được ứng dụng trong chẩn đoán bệnh nhiệt thán. Phản ứng kết tủa Ascoli.
41
Hình 5.1: Phản ứng kết tủa
3.2. Phản ứng kết tủa trong môi trường đặc
Dùng thạch Agar để tạo môi trường đặc: phần đặc chỉ chiếm 1- 2% khối lượng, 98 - 99% là chất lỏng. Thạch có cấu trúc dạng sợi nên tạo được một cấu trúc lưới trong không gian chứa được rất nhiều chất lỏng.
Nguyên tắc: Trong môi trường gel, kháng nguyên và kháng thể cách nhau một khoảng, chúng sẽ khuếch tán về phía nhau, rồi gặp nhau. Nếu kháng nguyên, kháng thể tương ứng sẽ kết hợp tạo phức hợp kháng nguyên - kháng
thể.
Tại vùng có lượng kháng ngun, kháng thể thích hợp đường tủa sẽ xuất hiện. Có thể quan sát được hoặc muốn rõ hơn thi nhuộm được.
Phản ứng kết tủa trong thạch trong ống nghiệm (kỹ thuật Oudin)
Có thể chia làm 2 loại:
Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch đơn:
Dùng một ống nghiệm có đường kính nhỏ, cho vào đó một lượng kháng thể đã trộn lẫn với thạch.
Trên mặt thạch cho một lượng dung dịch kháng nguyên. Kháng nguyên từ môi trường lỏng sẽ khuếch tán vào thạch, càng xuống sâu lượng kháng nguyên càng loãng.
Ở nơi tỷ lệ kháng nguyên và kháng thể tương ứng sẽ xuất hiện đường tủa dễ quan sát không bị tan khi lắc, thuận lợi khi di chuyển hoặc chụp ảnh.
Độ nhạy của phản ứng tăng gấp 2 - 3 lần so với khi thực hiện phản ứng trong môi trường lỏng.
Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch kép
Dùng một ống nghiệm có đường kính nhỏ, cho kháng thể vào trước, Rồi cho vào bên trên kháng thể một lượng thạch. Sau đó cho lên trên mặt thạch một lượng dung dịch kháng nguyên.
Kháng nguyên bên trên từ môi trường lỏng sẽ khuếch tán đi vào trong thạch, kháng thể bên dưới khuếch tán lên trên cũng đi vào trong thạch.
Ở nơi tỷ lệ kháng nguyên, kháng thể tương ứng sẽ xuất hiện đường kết tủa. Trong cùng một ống nghiệm nếu dùng nhiều cặp kháng nguyên, kháng thể khác nhau để chẩn đoán sẽ xuất hiện nhiều đường kết tủa riêng rẽ ở độ nông sâu khác nhau.
42
Phản ứng kết tủa trong thạch trên phiến kính hoặc đĩa petri (kỹ thuật Ouchterlony)
Thực chất là phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch kép, dễ làm, hay sử dụng. (Phản ứng AGP: Agar gel precipitation).
Trên phiến kính hoặc trên hộp petri, đổ một lớp thạch mỏng 1 - 2mm. Khi thạch đông lại, đục các lỗ trịn: đường kính của lỗ 4 - 5mm, khoảng cách từ lỗ trung tâm với lỗ xung quanh; 5 - 6mm.
Lỗ 1: Kháng nguyên đã biết. Lỗ 2: Kháng thể tương ứng.
Lỗ 3, 4, 5, 6: Kháng thể chưa biết.
Kháng nguyên và kháng thể cách nhau một khoảng trong thạch, chúng sẽ khuếch tán ra mọi phía, càng xa lỗ, nồng độ càng lỗng. ở nơi kháng nguyên, kháng thể tương ứng sẽ xuất hiện đường tủa.
Có thể dùng một hỗn hợp kháng thể để phát hiện nhiều kháng nguyên trong dung dịch. Lúc đõ sẽ xuất hiện nhiều đường tủa, mỗi đường tủa là một cặp đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể.
Có thể thấy nhiều loại kết quả:
Phản ứng giống hệt nhau: Khi 2 kháng nguyên y hệt nhau, thi các đường kết tủa sẽ nối liền nhau.
Phản ứng không giống hệt: Khi 2 kháng nguyên khác nhau, sẽ kết hợp riêng rẽ với 2 kháng thể, hai đường tủa sẽ cắt chéo nhau.
Phản ứng kết tủa khuếch tán điện
Là sự kết hợp phản ứng kết tủa với sự di chuyển trong điện trường. Đây là một cải tiến rất có ý nghĩa.
Dùng điện trường để đẩy nhanh tốc độ phản ứng kháng nguyên - kháng thể. Kháng thể trong điện trường di chuyển về cực âm. Kháng nguyên là chất bị hút về cực dương, chúng di chuyển gặp nhau nhanh hơn (1 - 2 giờ thay vi 24 - 48 giờ).
Phản ứng xảy ra cũng nhạy hơn (nhờ điện trường 90% kháng nguyên, kháng thể đi ngược chiều nhau để gặp nhau, thay vi khuếch tán tứ phía chỉ có 25% gặp nhau.
43
Dùng điện trường để di chuyển hỗn hợp kháng nguyên thành một dải kháng nguyên.
Sau đó cho kháng thể vào một rãnh song song với hàng kháng nguyên. Chúng sẽ khuếch tán, gặp nhau, các đường tủa sẽ nằm cách xa nhau, thay vì nằm tập trung vào một vùng chật hẹp. Vì vậy dễ quan sát và nhận định.
Miễn dịch điện di cho phép phát hiện kháng ngun có 30 loại protein thay vì 5 - 6 trong điện di thường.
Phản ứng kết hợp bổ thể (Phản ứng cố định bổ thể, phản ứng tiêu thụ bổ thể)
Là phản ứng huyết thanh học, có 3 thành phần tham gia: kháng nguyên, kháng thể và bổ thể.
Kháng thể trong phản ứng này thuộc lớp IgM, IgG có khả năng hoạt hố bổ thể. Khi kháng nguyên kết hợp với kháng thể tạo thành phức hợp kháng nguyên - kháng thể, nếu có mặt bổ thể bổ thể được hoạt hoá và gắn vào tạo thành: kháng nguyên - kháng thể - bổ thể.
Phản ứng được dùng để phát hiện kháng thể có khả năng hoạt hoá bổ thể và định lượng bổ thể có trong huyết thanh.
Phản ứng được thực hiện nhờ hai hệ thống: dung khuẩn, dung huyết và sự tham gia của bổ thể.
Hiện tượng dung khuẩn (Bacteriolysin)
Thí nghiệm của Faifơ (Pfaifer)
Năm 1894 ơng dùng vacxin phẩy khuẩn tả (vibrio cholerae) tiêm cho chuột lang để gây miễn dịch.
Đồng thời dùng chuột lang khác làm đối chứng không tiêm vacxin.
Sau 2 - 3 tuần dùng phẩy khuẩn tả cường độc tiêm vào phúc mạc cho cả 2 loại chuột lang này với liều gây chết.
Sau đó cứ 15 phút, 30 phút, 1 giờ, 2 giờ ông rút nước phúc mạc kiểm tra vi khuẩn dưới kính hiển vi và ni cấy vào mơi trường lỏng để quan sát tính chất mọc của nó thi thấy: