Khái niệm: Phản ứng kháng nguyên-kháng thể là sự kết hợp giữa kháng nguyên – kháng thể. Phản ứng xảy ra trong các điều kiện như: nhiệt độ, các muối của môi trường, cơ thể, chất bổ trợ, sự chuyển động của các phân tử,…liên kết chặt chẽ với nhau nhờ các lực lý-hóa.
Cơ chế: Khi cho kháng thể đặc hiệu tiếp xúc với kháng nguyên đã kích thích sinh ra chúng thi phản ứng kết hợp kháng nguyên + kháng thể sẽ xảy ra một cách đặc hiệu.
Phản ứng kết hợp này có thể xảy ra trong cơ thể động vật hay trong ống nghiệm.
Kháng thể dịch thể đặc hiệu thường tồn tại trong huyết thanh và chất dịch của cơ thể, nên phản ứng kết hợp giua kháng nguyên + kháng thể dịch thể gọi là phản ứng huyết thanh học.
39
Phương pháp chẩn đoán dựa vào phản ứng huyết thanh học gọi là phương pháp chẩn đoán huyết thanh học. Phương pháp này thường được thực hiện trong phịng thí nghiệm hay trên cơ thể động vật.
Việc dùng phản ứng kết hợp giưa kháng nguyên + kháng thể đặc hiệu cho phép ta xác định 1 kháng nguyên chưa biết bằng 1 kháng thể đã biết hoặc ngược lại.
2. Phân loại các phản ứng Kháng nguyên –Kháng thể
Phản ứng huyết thanh học chia làm 2 nhóm:
Nhóm thứ nhất: phát hiện kháng thể nhờ kháng nguyên đã biết. Nhóm thứ hai: phát hiện kháng nguyên nhờ kháng thể đã biết.
2.1. Nhóm phản ứng loại đơn giản
Loại 2 thành phần: kháng nguyên + kháng thể →kháng nguyên ....kháng thể. Phản ứng nhìn thấy được, ghi chép được gọi là phản ứng đơn giản trực tiếp (phản ứng HA). Trường hợp một thành phần phải gắn trên chất khối (hồng cầu) mới cho phép ta quan sát, được gọi là phản ứng đơn giản trực tiếp.
Trong phản ứng 2 thành phần chỉ có kháng thể hồn tồn (hóa trị 2) và kháng thể hồn tồn (đa hóa trị) thì kết quả mới có khả năng tạo ‘lưới’ nhìn thấy được. Cịn nếu 1 trong 2 thành phần khơng có hóa trị hồn tồn thì phản ứng sẽ không tạo ‘lưới’ không quan sát trực tiếp được.
Loại 3 thành phần:
Nhóm 1: sự kết hợp giũa kháng nguyên – kháng thể kết quả của phản ứng khơng nhìn thấy được, buộc chúng ta phải đọc kết quả gián tiếp theo sự tác động của kháng nguyên với hệ thống chỉ thị (động vật thí nghiệm, phơi gia cầm, môi trường thay đổi pH). Điển hình của nhóm phản ứng này là phản ứng trung hịa để xác định đặc tính của mầm bệnh (vi khuẩn, virus) hoặc các sản phẩm của chúng (độc tố).
Nhóm 2: kháng nguyên và kháng thể kết hợp với nhau cũng khơng nhìn thấy được, kết quả phản ứng được đánh giá theo thành phần thứ 3. Thành phần khi kêt hợp trước với kháng nguyên hoặc kháng thể sẽ làm mất đi sự biến đổi nhìn thấy được. Điển hình của nhóm phản ứng này là các phản ứng loại ức chế ngưng kết hồng cầu HI.
2.2. Nhóm phản ứng loại phức tạp
Thường được dùng để phát hiện kháng ngun hoặc kháng thể khơng hồn toàn. Khi tiến hành phản ứng chúng ta phải dùng nhiều thành phần, nhiều hệ thống
40
phản ứng mới phát hiện được kháng nguyên hoặc kháng thể. Điển hình là phản ứng kết hợp bổ thể, phản ứng miễn dịch huỳnh quang.
Sự kết hợp kháng nguyên, kháng thể tương ứng nhờ: Lực hút phân tử.
Lực Coulomb (lực hút tĩnh điện của 2 nhóm ion trái dấu). Lực hút giữa các phân tử đồng hóa trị.
Lực liên kết cầu nối Hydro của nhóm OH.
Trong phản ứng huyết thanh học thì những chất có cấu tạo bề mặt tương đối giống nhau thường cho các liên kết giống nhau (trong các phản ứng chéo).
3. Phản ứng kết tủa
3.1. Phản ứng kết tủa trong môi trường lỏng
Phản ứng kết tủa tạo vịng.
Là phản ứng có tính chất định tính.
Dùng 1 ống nghiệm nhỏ, cho vào đó một lượng kháng nguyên hoà tan (0.5ml).
Cho 0.5ml kháng huyết thanh vào, cho vào từ đáy ống, kháng huyết thanh sẽ đội kháng nguyên lên. Sau thời gian 15 – 20 phút tại vùng tiếp xúc sẽ xuất hiện một đĩa tủa mỏng.
Phản ứng này được ứng dụng trong chẩn đoán bệnh nhiệt thán. Phản ứng kết tủa Ascoli.
41
Hình 5.1: Phản ứng kết tủa
3.2. Phản ứng kết tủa trong môi trường đặc
Dùng thạch Agar để tạo môi trường đặc: phần đặc chỉ chiếm 1- 2% khối lượng, 98 - 99% là chất lỏng. Thạch có cấu trúc dạng sợi nên tạo được một cấu trúc lưới trong không gian chứa được rất nhiều chất lỏng.
Nguyên tắc: Trong môi trường gel, kháng nguyên và kháng thể cách nhau một khoảng, chúng sẽ khuếch tán về phía nhau, rồi gặp nhau. Nếu kháng nguyên, kháng thể tương ứng sẽ kết hợp tạo phức hợp kháng nguyên - kháng
thể.
Tại vùng có lượng kháng ngun, kháng thể thích hợp đường tủa sẽ xuất hiện. Có thể quan sát được hoặc muốn rõ hơn thi nhuộm được.
Phản ứng kết tủa trong thạch trong ống nghiệm (kỹ thuật Oudin)
Có thể chia làm 2 loại:
Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch đơn:
Dùng một ống nghiệm có đường kính nhỏ, cho vào đó một lượng kháng thể đã trộn lẫn với thạch.
Trên mặt thạch cho một lượng dung dịch kháng nguyên. Kháng nguyên từ môi trường lỏng sẽ khuếch tán vào thạch, càng xuống sâu lượng kháng nguyên càng loãng.
Ở nơi tỷ lệ kháng nguyên và kháng thể tương ứng sẽ xuất hiện đường tủa dễ quan sát không bị tan khi lắc, thuận lợi khi di chuyển hoặc chụp ảnh.
Độ nhạy của phản ứng tăng gấp 2 - 3 lần so với khi thực hiện phản ứng trong môi trường lỏng.
Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch kép
Dùng một ống nghiệm có đường kính nhỏ, cho kháng thể vào trước, Rồi cho vào bên trên kháng thể một lượng thạch. Sau đó cho lên trên mặt thạch một lượng dung dịch kháng nguyên.
Kháng nguyên bên trên từ môi trường lỏng sẽ khuếch tán đi vào trong thạch, kháng thể bên dưới khuếch tán lên trên cũng đi vào trong thạch.
Ở nơi tỷ lệ kháng nguyên, kháng thể tương ứng sẽ xuất hiện đường kết tủa. Trong cùng một ống nghiệm nếu dùng nhiều cặp kháng nguyên, kháng thể khác nhau để chẩn đoán sẽ xuất hiện nhiều đường kết tủa riêng rẽ ở độ nông sâu khác nhau.
42
Phản ứng kết tủa trong thạch trên phiến kính hoặc đĩa petri (kỹ thuật Ouchterlony)
Thực chất là phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch kép, dễ làm, hay sử dụng. (Phản ứng AGP: Agar gel precipitation).
Trên phiến kính hoặc trên hộp petri, đổ một lớp thạch mỏng 1 - 2mm. Khi thạch đông lại, đục các lỗ trịn: đường kính của lỗ 4 - 5mm, khoảng cách từ lỗ trung tâm với lỗ xung quanh; 5 - 6mm.
Lỗ 1: Kháng nguyên đã biết. Lỗ 2: Kháng thể tương ứng.
Lỗ 3, 4, 5, 6: Kháng thể chưa biết.
Kháng nguyên và kháng thể cách nhau một khoảng trong thạch, chúng sẽ khuếch tán ra mọi phía, càng xa lỗ, nồng độ càng lỗng. ở nơi kháng nguyên, kháng thể tương ứng sẽ xuất hiện đường tủa.
Có thể dùng một hỗn hợp kháng thể để phát hiện nhiều kháng nguyên trong dung dịch. Lúc đõ sẽ xuất hiện nhiều đường tủa, mỗi đường tủa là một cặp đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể.
Có thể thấy nhiều loại kết quả:
Phản ứng giống hệt nhau: Khi 2 kháng nguyên y hệt nhau, thi các đường kết tủa sẽ nối liền nhau.
Phản ứng không giống hệt: Khi 2 kháng nguyên khác nhau, sẽ kết hợp riêng rẽ với 2 kháng thể, hai đường tủa sẽ cắt chéo nhau.
Phản ứng kết tủa khuếch tán điện
Là sự kết hợp phản ứng kết tủa với sự di chuyển trong điện trường. Đây là một cải tiến rất có ý nghĩa.
Dùng điện trường để đẩy nhanh tốc độ phản ứng kháng nguyên - kháng thể. Kháng thể trong điện trường di chuyển về cực âm. Kháng nguyên là chất bị hút về cực dương, chúng di chuyển gặp nhau nhanh hơn (1 - 2 giờ thay vi 24 - 48 giờ).
Phản ứng xảy ra cũng nhạy hơn (nhờ điện trường 90% kháng nguyên, kháng thể đi ngược chiều nhau để gặp nhau, thay vi khuếch tán tứ phía chỉ có 25% gặp nhau.
43
Dùng điện trường để di chuyển hỗn hợp kháng nguyên thành một dải kháng nguyên.
Sau đó cho kháng thể vào một rãnh song song với hàng kháng nguyên. Chúng sẽ khuếch tán, gặp nhau, các đường tủa sẽ nằm cách xa nhau, thay vì nằm tập trung vào một vùng chật hẹp. Vì vậy dễ quan sát và nhận định.
Miễn dịch điện di cho phép phát hiện kháng ngun có 30 loại protein thay vì 5 - 6 trong điện di thường.
Phản ứng kết hợp bổ thể (Phản ứng cố định bổ thể, phản ứng tiêu thụ bổ thể)
Là phản ứng huyết thanh học, có 3 thành phần tham gia: kháng nguyên, kháng thể và bổ thể.
Kháng thể trong phản ứng này thuộc lớp IgM, IgG có khả năng hoạt hố bổ thể. Khi kháng nguyên kết hợp với kháng thể tạo thành phức hợp kháng nguyên - kháng thể, nếu có mặt bổ thể bổ thể được hoạt hoá và gắn vào tạo thành: kháng nguyên - kháng thể - bổ thể.
Phản ứng được dùng để phát hiện kháng thể có khả năng hoạt hoá bổ thể và định lượng bổ thể có trong huyết thanh.
Phản ứng được thực hiện nhờ hai hệ thống: dung khuẩn, dung huyết và sự tham gia của bổ thể.
Hiện tượng dung khuẩn (Bacteriolysin)
Thí nghiệm của Faifơ (Pfaifer)
Năm 1894 ông dùng vacxin phẩy khuẩn tả (vibrio cholerae) tiêm cho chuột lang để gây miễn dịch.
Đồng thời dùng chuột lang khác làm đối chứng không tiêm vacxin.
Sau 2 - 3 tuần dùng phẩy khuẩn tả cường độc tiêm vào phúc mạc cho cả 2 loại chuột lang này với liều gây chết.
Sau đó cứ 15 phút, 30 phút, 1 giờ, 2 giờ ông rút nước phúc mạc kiểm tra vi khuẩn dưới kính hiển vi và ni cấy vào mơi trường lỏng để quan sát tính chất mọc của nó thi thấy:
4. Phản ứng ngưng kết
Nguyên lý của phản ứng: có một số loại kháng nguyên ( virus )có khả năng gây ngưng kết với hồng cầu. Ví dụ như virus dịch tả gà (Newscatle) gây ngưng kết hồng cầu ngựa, mèo, chuột, bò, heo, gà, vịt ...
44
Lợi dụng tính chất gây ngưng kết này mà người ta tiến hành phản ứng ngưng kết để chẩn đốn và chứng minh sự có mặt của virus và xác định hiệu giá virus gây phản ứng ngưng kết.
Còn trong phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu là xác định hàm lượng kháng thể chống bệnh Newscatle trên gà.
Chuẩn bị hồng cầu gà, kháng nguyên và kháng huyết thanh:
Chế hồng cầu gà 1%: Dùng ống tiêm (seringe) sạch tráng qua dung dịch thuốc chống đông Citrat Natri 5%. Lấy 10 ml máu ở tỉnh mạch gà khỏe (gà không được tiêm vaccin và không nằm trong ổ dịch ) bơm vào ống nghiệm có chứa sẵn thuốc chống đông, trộn đêù và ly tâm với vận tốc 1000 vịng/phút trong 5 phút. Gạn bỏ phần nước trong phía trên, sau đó cho một lượng nước sinh lý mặn 9%o tương đương vào. Trộn đều và đem ly tâm tiếp tục.
Làm như vậy trong khoảng 2_3 lần cho hồng cầu sạch. Hồng cầu pha thành dung dịch 1% trong nước sinh lý mặn 9%o dung dich hồng cầu này để tủ lạnh có thể sử dụng được 1 tuần.
Chuẩn bị kháng nguyên (virus ): chuẩn bị nước trứng có virus Newscatle Thường sử dụng giống virus Newcastle chủng Lasota (chủng F, hoặc chủng B1). Lấy vaccin Newscatle pha thành dung dịch 1/10 tiêm 0,1ml vào xoang niệu mô của trứng gà ấp 10 ngày tuổi, sau 2-3 ngày phôi chết, để ở tủ lạnh 0 -40C trong 4 giờ. Mổ phôi gà hút lấy nước trứng giữ trong tủ đá sử dụng dần (3 tháng).
Kháng huyết thanh: Là huyết thanh của gà cần xét nghiệm.
Máu được cho vào trong ống nghiệm nằm nghiêng, đem để ở nhiệt độ phòng hoặc ở 40 C. Sau khi máu đông tách lấy phần huyết thanh. Nếu có lẫn hồng cầu đem ly tâm để tách huyết thanh riêng.
+ Tiến hành phản ứng
Muốn tiến hành phản ứng HI được thì phải tiến hành phản ứng HA trước để chuẩn độ kháng nguyên cho phản ứng HI.
4.1. Phản ứng ngưng kết hồng cầu HA
Phản ứng có thể tiến hành trong ống nghiệm hoặc trong tấm nhựa (tấm kính) có lỗ sẵn.
Phản ứng dương tính: hồng cầu ngưng kết lợn cợn, thành quầng rạn nứt dưới đáy ống nghiệm.
Phản ứng âm tính, như hồng cầu lắng xuống đáy ống nghiệm thành cục tròn giống như ống số 9 (ống đối chứng).
45
Hình 5.2: Phản ứng ngưng kết hồng cầu
Lưu ý : Khi đọc kết quả kkhông được cầm lên làm xáo trộn sự ngưng kết. Sau khi có kết quả ngưng kết thì ghi hiệu giá ngưng kết ở ống cuối cùng và ký hiệu là n để sau này tiến hành phản úng HI người ta sử dụng kháng nguyên có hiệu giá n-3 để có kết quả chắc chắn.
Sau khi hồng cầu đã ngưng kết thì hiện tượng này sẽ bị phá hủy dần theo thời gian nên cần phải theo dõi chặt chẽ.
4.2. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI
Cũng được tiến hành tương tự như phản úng trên nhưng khác ở chỗ kháng nguyên và kháng thể tác động với nhau thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể làm hồng cầu khơng cịn kháng nguyên tự do để gây hiện tượng ngưng kết và lắng xuống đáy ống nghiệm.
Trong phản ứng này kháng nguyên dùng là kháng nguyên có hiệu giá (n-3) và kháng thể sẽ được pha loãng theo sơ đồ phản ứng sau.
Bảng 5.1: Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu
0,5ml
0,5ml bỏ Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6 7 8
(ĐC)
46
Nước sinh lý (ml) 0,9 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Độ pha loãng KT 1/10 1/20 1/40 1/80 _ _ _ _
Kháng nguyên (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Lắc đều - để yên 15 - 30 phút cho kháng nguyên tác động với kháng thể
HC gà 1% (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Tổng số dd (ml) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
Trộn đều, để yên 15 -30 phút, đọc kết quả.
Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy thành cục tròn.
Phản ứng âm tính: Hồng cầu bị ngưng kết lợn cợn dưới đáy ống nghiệm thành quầng rạn nứt giống ống đối chứng số 9.
Lưu ý :
Nếu kết quả phản ứng khơng rõ thì tăng lượng kháng thể lên gấp đơi để trung hịa hết với kháng nguyên có thể bị dư trong phản ứng.
Kết quả phản ứng HI chạy ngược chiều với HA.
5. Thực hành
- Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA).
- Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI).
5.1. Chuẩn bị dụng cụ và mẫu vật
Hồng cầu gà, kháng nguyên và kháng huyết thanh.
5.2. Phương pháp tiến hành
Giáo viên hướng dẫn cho sinh viên cách thực hiện.
5.3. Nội dung thực hành
Thực hiện từng bước theo sự hướng dẫn của giáo viên.
5.4. Tổng kết nhận xét và đánh giá
Đánh giá kết quả thực hành dựa vào việc kiểm tra lại kiến thức sinh viên ghi nhận trong buổi thực hành.
47
Ghi chép đầy đủ, chính xác những thơng tin cần thiết. Sinh viên tham gia đầy đủ.
Tinh thần thái độ học tập nghiêm túc. Viết bài phúc trình.
CÂU HỎI ÔN TẬP
1. Nguyên lý và ưng dụng phản ứng kháng nguyên-kháng thể? 2. Phân loại các phản ứng KN-KT?
3. Phản ứng kết tủa trong môi trường lỏng, Phản ứng kết tủa trong môi trường đặc?
4. Phản ứng ngưng kết nhanh. Phản ứng ngưng kết chậm?
CHƯƠNG 6
VẮC-XIN VÀ HUYẾT THANH MH15-06
Giới thiệu:
Vaccine là chế phẩm sinh học có tính kháng ngun, có nguồn gốc từ vi sinh vật (có thể tồn thân hoặc một phần hoặc có cấu trúc tương tự) dùng để tạo miễn dịch đặc hiệu chủ động, nhằm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với một số tác nhân gây bệnh cụ thể.
Huyết thanh miễn dịch hay kháng huyết thanh còn gọi là globulin miễn dịch hay immunoglobulin là một lượng kháng thể có nguồn gốc từ người hoặc động vật, giúp cho cơ thể có kháng thể để dự phịng, điều trị bệnh, điều trị phối hợp và điều trị thay thế để chống lại các căn bệnh nguy hiểm, nhất là những căn bệnh về truyền nhiễm.
Mục tiêu: -Kiến thức:
+ Trình bày được định nghĩa về Vắc-xin và huyết thanh.
+ Giải thích về phương pháp sử dụng, bảo quản và chương trình tiêm chủng vắc-xin cho gia súc gia cầm.
48
+ Ứng dụng tiêm Vắc-xin, huyết thanh trong thực tế.
+ Phân loại và nhận biết được vắc-xin, huyết thanh cho gia súc gia cầm.