5.1. Ảnh hưởng của kháng nguyên
Kháng nguyên là yếu tố trước hết quyết định đến sự hình thành kháng thể. Có nhiều loại kháng nguyên, có nhiều cách đưa kháng nguyên vào cơ thể, do vậy ảnh hưởng của kháng ngun có tính chất quyết định đến q trình hình thành kháng thể và hàm lượng kháng thể.
- Ảnh hưởng của bản chất, cấu trúc kháng nguyên: Kháng ngun là protein, có tính kháng ngun cao, kích thích cơ thể sản sinh nhiều kháng thể hơn so với các kháng nguyên khác: Gluxit, lipit.
Ví dụ:
Với virus thích ứng trên tế bào thượng bì thì đưa vaccin vào cơ thể bằng cách chủng dưới da.
Virus Newcastle thuộc nhóm Lentogen: Lasota, F, B1, V4 nhân lên tốt trên tế bào của niêm mạc đường hơ hấp, tiêu hố nên đưa vaccin loại này qua niêm mạc đường hơ hấp, tiêu hố,...
Trong sử dụng vaccin, thường hay đưa vaccin vào cơ thể bằng cách tiêm dưới da vì kháng nguyên qua da sẽ vào mạch bạch huyết và tổ chức hạch lympho, là nơi tiếp nhận kháng nguyên để sản xuất kháng thể.
Đưa kháng nguyên vào cơ thể qua đường tiêu hố ít sử dụng do pH của dạ dày thấp, các enzym của đường tiêu hoá sẽ tác động làm kháng nguyên bị phân giải hoặc thay đổi cấu trúc kháng nguyên dẫn đến kháng thể sản sinh ra ít.
Theo một số tác giả nếu đưa kháng nguyên vào cơ thể bằng đường tiêu hố, hơ hấp liều lượng kháng nguyên gấp 10 - 100 lần liều kháng nguyên đưa vào dưới da.
-Ảnh hưởng của đường xâm nhập của kháng nguyên vào cơ thể. Ví dụ:
Với virus thích ứng trên tế bào thượng bì thì đưa vaccin vào cơ thể bằng cách chủng dưới da.
Virus Newcastle thuộc nhóm Lentogen: Lasota, F, B1, V4 nhân lên tốt trên tế bào của niêm mạc đường hơ hấp, tiêu hố nên đưa vaccin loại này qua niêm mạc
35 đường hơ hấp, tiêu hố,...
Trong sử dụng vaccin, thường hay đưa vaccin vào cơ thể bằng cách tiêm dưới da vì kháng nguyên qua da sẽ vào mạch bạch huyết và tổ chức hạch lympho, là nơi tiếp nhận kháng nguyên để sản xuất kháng thể.
Đưa kháng nguyên vào cơ thể qua đường tiêu hố ít sử dụng do pH của dạ dày thấp, các enzym của đường tiêu hoá sẽ tác động làm kháng nguyên bị phân giải hoặc thay đổi cấu trúc kháng nguyên dẫn đến kháng thể sản sinh ra ít.
Theo một số tác giả nếu đưa kháng ngun vào cơ thể bằng đường tiêu hố, hơ hấp liều lượng kháng nguyên gấp 10 - 100 lần liều kháng nguyên đưa vào dưới da.
-Ảnh hưởng của liều lượng kháng nguyên: Liều lượng kháng nguyên đưa vào cơ thể nhiều, lượng kháng thể sinh ra nhiều. Nhưng lượng kháng nguyên chỉ có một giới hạn nhất định vì nếu lượng kháng nguyên nhiều quá sẽ gây độc cho cơ thể hoặc gây tê liệt miễn dịch, có thể gây hiện tượng dung nạp miễn dịch, kháng thể không được sản xuất ra.
-Ảnh hưởng của những lần đưa kháng nguyên vào cơ thể: Đưa kháng nguyên vào cơ thể, sau một thời gian đưa kháng nguyên nhắc lại một hoặc vài lần. Kết quả là kháng thể lần sau xuất hiện sớm hơn, lượng kháng thể nhiều hơn so với lần trước. Có hiện tượng này là do vài trị của các tế bào nhớ miễn dịch.
-Ảnh hưởng của sự phối hợp các kháng nguyên: Cùng một lúc đưa nhiều loại kháng nguyên vào cơ thể với liều thích hợp, các loại kháng thể được tạo ra ngang bằng hay nhiều hơn khi đưa kháng nguyên vào riêng từng loại. Hiện tượng này gọi là sự công lực kháng nguyên. Nhưng nếu đưa nhiều loại kháng nguyên vào cơ thể với liều khơng thích hợp, kết quả sẽ ngược lại.
Hiện tượng công lực kháng nguyên được ứng dụng vào việc chế tạo vaccin đa giá phòng bệnh cho người và gia súc.
Ví dụ:
Người: Vaccin PTD phòng 3 bệnh (ho gà, uốn ván, bạch hầu). Gia súc: Vaccin tụ dấu 3-2 phòng hai bệnh tụ huyết trùng và đóng dấu lợn. Gia cầm: Vaccin Newcasthe + Gumboro + Bronchitis Infectious + Reovirus. Vaccin Newcasthe + đậu gà.
Vaccin Tetradog phịng 4 bệnh ở chó do virus Care, Adenovirus, Parvovirus, Xoắn khuẩn Leptospira gây ra.
Vaccin nhị liên, tam liên của Phân viện thú y miền trung phòng 2 bệnh (thương hàn và tụ huyết trùng lợn), 3 bệnh (thương hàn, tụ huyết trùng và dịch tả
36 lợn).
-Ảnh hưởng của chất bổ trợ kháng nguyên: Chất bổ trợ là chất cho thêm vào trong vaccin, làm hiệu lực của vaccin cao hơn.
Kích thích miễn dịch do bản thân chất bổ trợ gây phản ứng viêm nhẹ, lôi kéo các đại thực bào và các tế bào có thẩm quyền miễn dịch khác.
Hấp thụ kháng nguyên, khoanh vùng kháng ngun, làm chậm q trình giải phóng kháng ngun tại vị trí tiêm, do đó kháng ngun tồn tại lâu trong cơ thể, kéo dài sự trình diện kháng nguyên.
5.2. Ảnh hưởng của kháng thể
Cơ thể trưởng thành hệ thống cơ quan, tế bào miễn dịch hoàn thiện cho đáp ứng miễn dịch mạnh và lượng kháng thể sinh ra nhiều hơn. Khi về già cơ quan miễn dịch suy giảm, đáp ứng miễn dịch giảm, đặc biệt là giảm miễn dịch tế bào nên lượng kháng thể giảm. Cơ thể còn non, hệ thống miễn dịch chưa phất triển hoàn chỉnh nên đáp ứng miễn dịch chưa mạnh. Cơ thể khoẻ mạnh sản sinh kháng thể nhiều hơn cơ thể ốm, bệnh tật.
Tuổi tác: ở động vật trưởng thành khả năng hình thành kháng thể mạnh hơn ở động vật non và động vật già.
Sức đề kháng: động vật có sức đề kháng cao thì khả năng hình thành kháng thể mạnh.
Trạng thái dinh dưỡng: dinh dưỡng tốt, khả năng hình thành kháng thể mạnh. Trạng thái thần kinh: thần kinh hưng phấn có khả năng hình thành kháng thể mạnh hơn thần kinh ở trạng thái ù lì.
5.3. Ảnh hưởng của yếu tố ngoại cảnh
Chế độ dinh dưỡng tốt cho lượng kháng thể nhiều hơn so với cơ thể suy dinh dưỡng. ở những cơ thể suy dinh dưỡng, hoạt động của cơ quan lympho giảm, rối loạn đáp ứng miễn dịch: miễn dịch tế bào giảm, thực bào giảm, miễn dịch dịch thể giảm...
Ví dụ: Thiếu đạm (protein) dẫn đến lượng kháng thể giảm do bản chất của kháng thể là protein.
Nhiều kẽm (Zn) làm giảm yếu tố dịch thể của tuyến ức do đó gây suy giảm miễn dịch tế bào,...
6. Thực hành
Một số loại kháng thể chính dùng trong phản ứng miễn dịch.
37
Các loại kháng thể dùng cho gia súc gia cầm.
6.2. Phương pháp tiến hành
Giáo viên hướng dẫn cho sinh viên cách nhận biết và phân loại các loại kháng thể dùng cho gia súc gia cầm.
6.3. Nội dung thực hành
Thực hiện từng bước theo sự hướng dẫn của giáo viên.
6.4. Tổng kết nhận xét và đánh giá
Đánh giá kết quả thực hành dựa vào việc kiểm tra lại kiến thức sinh viên ghi nhận trong buổi thực hành.
Ghi chép đầy đủ, chính xác những thông tin cần thiết. Sinh viên tham gia đầy đủ.
Tinh thần thái độ học tập nghiêm túc. Viết bài phúc trình.
CÂU HỎI ƠN TẬP
1. Định nghĩa và bản chất của kháng thể? 2. Đặc tính của kháng thể?
3. Các lớp kháng thể?
4. Quy luật hình thành kháng thể đặc hiệu?
38 CHƯƠNG 5 PHẢN ỨNG KẾT HỢP KHÁNG NGUYÊN - KHÁNG THỂ MH15-05 Giới thiệu: Phản ứng kháng nguyên + kháng thể dịch thể là phản ứng hóa học rất đặc hiệu dùng để xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh và không đặc hiệu chỉ được sử dụng để xác định kháng nguyên nhờ kháng thể đã biết.
Để phát hiện phản ứng này có các kỹ thuật sau đây liên quan đến huyết học - truyền máu.
Mục tiêu: -Kiến thức:
Giải thích, phân tích được các nguyên lý và ứng dụng giữa kháng nguyên và kháng thể.
-Kỹ năng:
Thực hiện các ứng dụng trong phịng thí nghiệm cũng như thực tế về các phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể.
-Năng lực tự chủ và trách nhiệm: Rèn luyện tính cẩn thận, tỉ mỉ trong công tác
miễn dịch.
1. Nguyên lý và ứng dụng phản ứng kháng nguyên-kháng thể
Khái niệm: Phản ứng kháng nguyên-kháng thể là sự kết hợp giữa kháng nguyên – kháng thể. Phản ứng xảy ra trong các điều kiện như: nhiệt độ, các muối của môi trường, cơ thể, chất bổ trợ, sự chuyển động của các phân tử,…liên kết chặt chẽ với nhau nhờ các lực lý-hóa.
Cơ chế: Khi cho kháng thể đặc hiệu tiếp xúc với kháng nguyên đã kích thích sinh ra chúng thi phản ứng kết hợp kháng nguyên + kháng thể sẽ xảy ra một cách đặc hiệu.
Phản ứng kết hợp này có thể xảy ra trong cơ thể động vật hay trong ống nghiệm.
Kháng thể dịch thể đặc hiệu thường tồn tại trong huyết thanh và chất dịch của cơ thể, nên phản ứng kết hợp giua kháng nguyên + kháng thể dịch thể gọi là phản ứng huyết thanh học.
39
Phương pháp chẩn đoán dựa vào phản ứng huyết thanh học gọi là phương pháp chẩn đoán huyết thanh học. Phương pháp này thường được thực hiện trong phịng thí nghiệm hay trên cơ thể động vật.
Việc dùng phản ứng kết hợp giưa kháng nguyên + kháng thể đặc hiệu cho phép ta xác định 1 kháng nguyên chưa biết bằng 1 kháng thể đã biết hoặc ngược lại.
2. Phân loại các phản ứng Kháng nguyên –Kháng thể
Phản ứng huyết thanh học chia làm 2 nhóm:
Nhóm thứ nhất: phát hiện kháng thể nhờ kháng nguyên đã biết. Nhóm thứ hai: phát hiện kháng nguyên nhờ kháng thể đã biết.
2.1. Nhóm phản ứng loại đơn giản
Loại 2 thành phần: kháng nguyên + kháng thể →kháng nguyên ....kháng thể. Phản ứng nhìn thấy được, ghi chép được gọi là phản ứng đơn giản trực tiếp (phản ứng HA). Trường hợp một thành phần phải gắn trên chất khối (hồng cầu) mới cho phép ta quan sát, được gọi là phản ứng đơn giản trực tiếp.
Trong phản ứng 2 thành phần chỉ có kháng thể hồn tồn (hóa trị 2) và kháng thể hồn tồn (đa hóa trị) thì kết quả mới có khả năng tạo ‘lưới’ nhìn thấy được. Cịn nếu 1 trong 2 thành phần khơng có hóa trị hồn tồn thì phản ứng sẽ khơng tạo ‘lưới’ không quan sát trực tiếp được.
Loại 3 thành phần:
Nhóm 1: sự kết hợp giũa kháng nguyên – kháng thể kết quả của phản ứng khơng nhìn thấy được, buộc chúng ta phải đọc kết quả gián tiếp theo sự tác động của kháng nguyên với hệ thống chỉ thị (động vật thí nghiệm, phơi gia cầm, mơi trường thay đổi pH). Điển hình của nhóm phản ứng này là phản ứng trung hòa để xác định đặc tính của mầm bệnh (vi khuẩn, virus) hoặc các sản phẩm của chúng (độc tố).
Nhóm 2: kháng nguyên và kháng thể kết hợp với nhau cũng khơng nhìn thấy được, kết quả phản ứng được đánh giá theo thành phần thứ 3. Thành phần khi kêt hợp trước với kháng nguyên hoặc kháng thể sẽ làm mất đi sự biến đổi nhìn thấy được. Điển hình của nhóm phản ứng này là các phản ứng loại ức chế ngưng kết hồng cầu HI.
2.2. Nhóm phản ứng loại phức tạp
Thường được dùng để phát hiện kháng ngun hoặc kháng thể khơng hồn toàn. Khi tiến hành phản ứng chúng ta phải dùng nhiều thành phần, nhiều hệ thống
40
phản ứng mới phát hiện được kháng nguyên hoặc kháng thể. Điển hình là phản ứng kết hợp bổ thể, phản ứng miễn dịch huỳnh quang.
Sự kết hợp kháng nguyên, kháng thể tương ứng nhờ: Lực hút phân tử.
Lực Coulomb (lực hút tĩnh điện của 2 nhóm ion trái dấu). Lực hút giữa các phân tử đồng hóa trị.
Lực liên kết cầu nối Hydro của nhóm OH.
Trong phản ứng huyết thanh học thì những chất có cấu tạo bề mặt tương đối giống nhau thường cho các liên kết giống nhau (trong các phản ứng chéo).
3. Phản ứng kết tủa
3.1. Phản ứng kết tủa trong mơi trường lỏng
Phản ứng kết tủa tạo vịng.
Là phản ứng có tính chất định tính.
Dùng 1 ống nghiệm nhỏ, cho vào đó một lượng kháng nguyên hoà tan (0.5ml).
Cho 0.5ml kháng huyết thanh vào, cho vào từ đáy ống, kháng huyết thanh sẽ đội kháng nguyên lên. Sau thời gian 15 – 20 phút tại vùng tiếp xúc sẽ xuất hiện một đĩa tủa mỏng.
Phản ứng này được ứng dụng trong chẩn đoán bệnh nhiệt thán. Phản ứng kết tủa Ascoli.
41
Hình 5.1: Phản ứng kết tủa
3.2. Phản ứng kết tủa trong môi trường đặc
Dùng thạch Agar để tạo môi trường đặc: phần đặc chỉ chiếm 1- 2% khối lượng, 98 - 99% là chất lỏng. Thạch có cấu trúc dạng sợi nên tạo được một cấu trúc lưới trong không gian chứa được rất nhiều chất lỏng.
Nguyên tắc: Trong môi trường gel, kháng nguyên và kháng thể cách nhau một khoảng, chúng sẽ khuếch tán về phía nhau, rồi gặp nhau. Nếu kháng nguyên, kháng thể tương ứng sẽ kết hợp tạo phức hợp kháng nguyên - kháng
thể.
Tại vùng có lượng kháng ngun, kháng thể thích hợp đường tủa sẽ xuất hiện. Có thể quan sát được hoặc muốn rõ hơn thi nhuộm được.
Phản ứng kết tủa trong thạch trong ống nghiệm (kỹ thuật Oudin)
Có thể chia làm 2 loại:
Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch đơn:
Dùng một ống nghiệm có đường kính nhỏ, cho vào đó một lượng kháng thể đã trộn lẫn với thạch.
Trên mặt thạch cho một lượng dung dịch kháng nguyên. Kháng nguyên từ môi trường lỏng sẽ khuếch tán vào thạch, càng xuống sâu lượng kháng nguyên càng loãng.
Ở nơi tỷ lệ kháng nguyên và kháng thể tương ứng sẽ xuất hiện đường tủa dễ quan sát không bị tan khi lắc, thuận lợi khi di chuyển hoặc chụp ảnh.
Độ nhạy của phản ứng tăng gấp 2 - 3 lần so với khi thực hiện phản ứng trong môi trường lỏng.
Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch kép
Dùng một ống nghiệm có đường kính nhỏ, cho kháng thể vào trước, Rồi cho vào bên trên kháng thể một lượng thạch. Sau đó cho lên trên mặt thạch một lượng dung dịch kháng nguyên.
Kháng nguyên bên trên từ môi trường lỏng sẽ khuếch tán đi vào trong thạch, kháng thể bên dưới khuếch tán lên trên cũng đi vào trong thạch.
Ở nơi tỷ lệ kháng nguyên, kháng thể tương ứng sẽ xuất hiện đường kết tủa. Trong cùng một ống nghiệm nếu dùng nhiều cặp kháng nguyên, kháng thể khác nhau để chẩn đoán sẽ xuất hiện nhiều đường kết tủa riêng rẽ ở độ nông sâu khác nhau.
42
Phản ứng kết tủa trong thạch trên phiến kính hoặc đĩa petri (kỹ thuật Ouchterlony)
Thực chất là phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch kép, dễ làm, hay sử dụng. (Phản ứng AGP: Agar gel precipitation).
Trên phiến kính hoặc trên hộp petri, đổ một lớp thạch mỏng 1 - 2mm. Khi thạch đơng lại, đục các lỗ trịn: đường kính của lỗ 4 - 5mm, khoảng cách từ lỗ trung tâm với lỗ xung quanh; 5 - 6mm.
Lỗ 1: Kháng nguyên đã biết. Lỗ 2: Kháng thể tương ứng.
Lỗ 3, 4, 5, 6: Kháng thể chưa biết.
Kháng nguyên và kháng thể cách nhau một khoảng trong thạch, chúng sẽ khuếch tán ra mọi phía, càng xa lỗ, nồng độ càng loãng. ở nơi kháng nguyên, kháng thể tương ứng sẽ xuất hiện đường tủa.
Có thể dùng một hỗn hợp kháng thể để phát hiện nhiều kháng nguyên trong dung dịch. Lúc đõ sẽ xuất hiện nhiều đường tủa, mỗi đường tủa là một cặp đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể.
Có thể thấy nhiều loại kết quả:
Phản ứng giống hệt nhau: Khi 2 kháng nguyên y hệt nhau, thi các đường kết tủa sẽ nối liền nhau.
Phản ứng không giống hệt: Khi 2 kháng nguyên khác nhau, sẽ kết hợp riêng rẽ với 2 kháng thể, hai đường tủa sẽ cắt chéo nhau.
Phản ứng kết tủa khuếch tán điện
Là sự kết hợp phản ứng kết tủa với sự di chuyển trong điện trường. Đây là một cải tiến rất có ý nghĩa.
Dùng điện trường để đẩy nhanh tốc độ phản ứng kháng nguyên - kháng thể. Kháng thể trong điện trường di chuyển về cực âm. Kháng nguyên là chất bị hút về cực dương, chúng di chuyển gặp nhau nhanh hơn (1 - 2 giờ thay vi 24 - 48 giờ).
Phản ứng xảy ra cũng nhạy hơn (nhờ điện trường 90% kháng nguyên, kháng thể đi ngược chiều nhau để gặp nhau, thay vi khuếch tán tứ phía chỉ có 25% gặp nhau.
43
Dùng điện trường để di chuyển hỗn hợp kháng nguyên thành một dải kháng nguyên.
Sau đó cho kháng thể vào một rãnh song song với hàng kháng nguyên.