Chƣơng 2 : MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.1. Điều tra thành phần, mật độ các loại nấm có trong đất
+ Xác định thành phần lồi nấm có trong đất
- Lấy mẫu đất: Lấy mẫu đất theo các ơ dạng bản có diện tích 1m2, mỗi địa điểm lấy mẫu lập 3 ô dạng bản (chân, sƣờn, đỉnh), ở các loại rừng trồng khác nhau: rừng trồng thông, rừng trồng Keo tai tƣợng, rừng trồng keo lai tại các huyện Đồng Hỷ (xã Khe Mo), huyện Phú Lƣơng (xã Túc Tranh), huyện Võ Nhai (xã Liên Minh), Thành phố Thái Nguyên (Xã Tân Cƣơng), huyện Phú Bình (xã Bàn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Đạt), huyện Định Hóa và huyện Đại Từ; mẫu đất đƣợc lấy độ sâu 0 - 10 cm. Mỗi ô dạng bản lấy 1 mẫu. Tổng số mẫu đất 45 mẫu.
Mẫu đất đƣợc đựng trong túi nilon sạch có ghi đầy đủ thông tin về địa điểm lấy mẫu.
- Chuẩn bị dụng cụ:
Rửa hộp lồng cho sạch sau đó để khơ, bọc kín bằng giấy báo và cho vào nồi hấp khử trùng ở 1210C tƣơng đƣơng với áp suất 1atm trong thời gian 45 phút. Sau đó cho vào tủ sấy đặt ở 1100C, để qua đêm.
- Chuẩn bị môi trƣờng:
+ Môi trƣờng phân lập nấm từ đất (Môi trƣờng PDA - Potato Dextrose Agar + kháng sinh) gồm: Khoai tây : 200g D-glucose : 20g Agar : 18g Nƣớc : 1000ml Ampicilin : 100mg
Khoai tây rửa sạch, cắt miếng có kích thƣớc khoảng 1 x 1 x 1cm, cho vào nồi cùng 1000ml nƣớc, đun sơi trong 30 phút, sau đó lọc lấy nƣớc trong, thêm nƣớc cho đủ 1000ml. Đun nhẹ và cho D-Gluco, Agar vào quấy đều, đổ hỗn hợp ra các bình tam giác, nút bơng và cuốn giấy lên miệng bình. Hấp khử trùng mơi trƣờng ở 1210C (tƣơng đƣơng 1atm) trong 30 phút, sau đó cho kháng sinh vào lắc đều và đổ ra các hộp lồng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Môi trƣờng PDA thuần khiết để cấy truyền nấm gồm: Khoai tây : 200g
D- gluco : 20g Agar : 18g Nƣớc cất : 1000ml
Tiến hành làm môi trƣờng PDA tƣơng tự nhƣ trên (không cho kháng sinh).
- Phân lập các lồi nấm có trong đất: Phân lập các lồi nấm ký sinh cơn trùng
đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp phân lập nấm trực tiếp từ đất theo phƣơng pháp pha loãng tới hạn.
Cân 10 gam đất pha loãng với 90ml nƣớc vô trùng trong hộp nhựa, dùng máy rung từ để hịa tan mẫu đất; dung dịch này đƣợc tính là nồng độ 10-1. Tiếp tục pha loãng đến nồng độ 10-4
bằng cách lấy 10ml ở nồng độ 10-1 pha vào 90ml nƣớc vô trùng khác đƣợc 10-2
và cứ nhƣ vậy đến nồng độ 10-4. Dùng pipét vô trùng lấy 0.01ml dịch mẫu ở các nồng độ từ 10-2
đến 10-4 cho vào đĩa Peptri chứa sẵn mơi trƣờng PDA + kháng sinh, sau đó trang đều, băng kín và ni trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 25- 300C. Sau khoảng 3- 5 ngày quan sát thấy xuất hiện các hệ sợi nấm. Tiến hành đếm mật độ của từng chủng nấm và phân lập riêng chúng bằng việc cấy truyền sang các đĩa Peptri khác có chứa mơi trƣờng PDA. Đồng thời quan sát các đặc điểm hình thái của nấm nhƣ: mầu sắc, hình dạng. Căn cứ vào những đặc điểm đó để ký hiệu các chủng nấm phân lập đƣợc.